HSV-TK-GCV系統(tǒng)對(duì)鼠膀胱癌局部-遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、某些特定的酶蛋白基因如HSV-TK,CD基因等編碼的酶蛋白可以使一些無毒或低毒的前藥轉(zhuǎn)化為強(qiáng)細(xì)胞毒性物質(zhì)，殺死腫瘤細(xì)胞，被稱為自殺基因。自殺基因(suicidegene)廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的基因治療，目前已經(jīng)建立多個(gè)自殺基因系統(tǒng)，如HSV-TK/GCV,5-FC/CD.其中最有代表性的為單純皰疹病毒Ⅰ型胸腺嘧啶核苷激酶(HSV1-TK)基因/丙氧鳥苷(ganciclovir,GCV)系統(tǒng)，其通過單純皰疹病毒胸苷激酶將抗病毒核酸類似物GC

2、V磷酸化，抑制DNA合成、導(dǎo)致細(xì)胞死亡。現(xiàn)在該基因已被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤治療研究，美國(guó)等國(guó)家正式批準(zhǔn)該基因進(jìn)入臨床治療腫瘤。自殺基因治療的一個(gè)特點(diǎn)是能引起轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的腫瘤細(xì)胞死亡，還能產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)(bystandereffect)即轉(zhuǎn)移基因陽性表達(dá)細(xì)胞的死亡可引起臨近的陰性細(xì)胞的死亡。目前研究又發(fā)現(xiàn)，HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)不但對(duì)臨近陰性細(xì)胞可引起其死亡，對(duì)身體其他部位的基因表達(dá)陰性細(xì)胞也可引起其死亡。稱為遠(yuǎn)距離旁

3、觀者效應(yīng)(distantbystandereffect)。關(guān)于旁觀者效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制目前尚無定論，目前普遍贊同的是縫隙連接機(jī)制以及免疫學(xué)機(jī)制.本實(shí)驗(yàn)采用將在小鼠背部皮下建立膀胱癌轉(zhuǎn)移癌模型，在GCV的作用下，觀察HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用以及局部旁觀者效應(yīng)及對(duì)其他部位轉(zhuǎn)移癌的遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)的效果。及旁觀者效應(yīng)機(jī)理進(jìn)行初步的研究。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果總結(jié)如下： 1.本實(shí)驗(yàn)在體外采用DOTAP試劑將含HyTK基因的逆轉(zhuǎn)錄

4、病毒載體成功的導(dǎo)入包裝細(xì)胞PA317，獲得含HyTK基因的病毒上清，而后感染膀胱癌細(xì)胞T739，潮霉素B篩選后獲得了T739-TK細(xì)胞。RT-PCR證實(shí)有HyTK基因的插入并有其mRNA的表達(dá)。 2.在BALB/c近交系小鼠動(dòng)物背部皮下誘導(dǎo)腫瘤模型分析TK基因?qū)δ[瘤的殺傷作用以及局部旁觀者效應(yīng)，動(dòng)物隨機(jī)分為3組，A組：背部皮下注射100％已經(jīng)轉(zhuǎn)染TK基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液；B組：背部皮下注射含50％已經(jīng)轉(zhuǎn)染TK

5、基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液；對(duì)照組：背部皮下注射未轉(zhuǎn)染TK基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液。腹腔注射GCV，劑量75mg/kg。于第3，7，14天測(cè)量小鼠背部腫瘤大小變化，于第7天隨機(jī)處死每組小鼠3只。取背部腫瘤作蘇木精伊紅染色觀察病理學(xué)形態(tài)。并統(tǒng)計(jì)每組除處死外小鼠的自然存活天數(shù)。并冰凍保存標(biāo)本.發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TK基因的腫瘤在GCV治療后生長(zhǎng)相對(duì)于對(duì)照組明顯緩慢，小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng).且50％與100％轉(zhuǎn)染TK基因的腫瘤的生

6、長(zhǎng)狀況及小鼠生存時(shí)間并無明顯差別.說明TK基因?qū)δ[瘤的殺傷效應(yīng)明顯，且局部存在旁觀者效應(yīng)。 3.在BALB/c近交系小鼠動(dòng)物背部皮下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移瘤瘤模型以觀察遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)，動(dòng)物隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組：左側(cè)背部皮下注射含已經(jīng)轉(zhuǎn)染TK基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液，右側(cè)背部皮下注射未含轉(zhuǎn)染TK基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液。對(duì)照組：雙側(cè)背部皮下注射未轉(zhuǎn)染TK基因3×105T739腫瘤細(xì)胞PBS懸液；腹腔注射GCV，

7、劑量75mg/kg。于第3，7，14天測(cè)量小鼠背部腫瘤大小變化，于第7天隨機(jī)處死每組小鼠3只。取背部腫瘤作蘇木精伊紅染色觀察病理學(xué)形態(tài)。并統(tǒng)計(jì)每組除處死外小鼠的自然存活天數(shù)。并冰凍保存標(biāo)本.發(fā)現(xiàn)TK+腫瘤在GCV治療后對(duì)遠(yuǎn)距離的TK-腫瘤的生長(zhǎng)并無明顯抑制作用，小鼠生存時(shí)間并未明顯延長(zhǎng).認(rèn)為遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)并不明顯。 4.取局部旁觀者效應(yīng)組，遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)組，對(duì)照組腫瘤組織切片作免疫組化分析，觀察CD4,CD8陽性的淋巴細(xì)胞的

8、表達(dá)情況，以分析免疫機(jī)制在旁觀者效應(yīng)中所起的作用.發(fā)現(xiàn)CD4CD8陽性的淋巴細(xì)胞在局部旁觀者效應(yīng)實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中有明顯表達(dá)，但是在遠(yuǎn)距離旁觀者效組腫瘤組織中表達(dá)并不明顯。 5.通過免疫組化觀察正常小鼠膀胱組織標(biāo)本、以及小鼠膀胱癌組織標(biāo)本中Cx26表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)Cx26在正常膀胱粘膜移行上皮細(xì)胞中均勻陽性表達(dá)，而在腫瘤組織中，表達(dá)降低或不表達(dá)。說明膀胱癌中連接蛋白表達(dá)降低或異常分布，極有可能使腫瘤細(xì)胞間的連接通訊下降，從而影響旁觀