微囊泡在介導急性中長波紫外線輻射“旁觀者效應”中的作用.pdf

1、日光中紫外線所致的皮膚光損傷疾病一直是人們關注的一類熱點疾病。研究表明，紫外線除了引起受輻射細胞的直接損傷外，還可以通過紫外線輻射旁效應（Ultraviolet irradiation induced bystander effects，UV-BE）引起臨近細胞的間接損傷。近年來，有關紫外線輻射旁效應的研究，已經(jīng)覆蓋體內(nèi)外多種光損傷模型。研究者發(fā)現(xiàn)不同波段的紫外線均可產(chǎn)生多種旁觀者效應。此外，不同劑量紫外線也可誘導不同強度的旁觀者效應。

2、種種證據(jù)表明，紫外線輻射旁效應可能在加劇皮膚光損傷和光致癌等重要病理過程中發(fā)揮重要作用。既往旁效應的研究主要集中于離子輻射，盡管紫外線作為一種非離子射線，其誘發(fā)旁效應的證據(jù)已經(jīng)建立得很充分，而這一機制發(fā)生的生化、分子機制研究目前卻剛剛起步，這一方面的研究已經(jīng)得到眾多學者的關注。
　　近年來，微囊泡(microvesicles，MVs)的功能和其攜帶的信息物質(zhì)是生物學研究一大熱點。研究報道受到離子輻射的細胞可向外分泌微囊泡，它是細胞

3、出芽與細胞膜融合后直接脫落形成的囊性結構，并攜帶蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和DNA，參與細胞間的信息傳遞，介導旁效應的產(chǎn)生。
　　目的：
　　觀察急性中長波紫外線輻射誘導皮膚成纖維細胞微囊泡的生成及其對人皮膚成纖維細胞形態(tài)，增殖活性，氧化損傷及凋亡的影響。
　　方法：
　　1.中長波紫外線輻射誘導皮膚成纖維細胞微囊泡的生成及鑒定
　　分別采用不同劑量中長波紫外線(Ultraviolet A/Ultravi

4、olet B，UVA/UVB)輻射人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF），建立急性光損傷細胞模型。本研究中采用的UVA輻射劑量為10J/cm2和20J/cm2; UVB輻射劑量為30mJ/cm2和60mJ/cm2。用特別配置的無微囊泡(microvesicles，MVs)培養(yǎng)基孵育HSF，經(jīng)上述劑量UVA和UVB輻射細胞后，于照射后0.5h、24h、48h、72h分離提取細胞上清液中的MVs。隨后使用透

5、射電鏡及光散射分析技術檢測所獲得的MVs大小及含量，BCA蛋白定量法測定各組細胞上清中MVs蛋白的含量，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting，WB)檢測MVs表面蛋白。
　　2.急性中長波紫外線輻射誘導生成的微囊泡對人皮膚成纖維細胞形態(tài)、增殖活性、氧化損害及凋亡的影響
　　采用UVA(20J/cm2)及UVB(60mJ/cm2)對HSF進行急性輻射，收集培養(yǎng)24h后上清液中的MVs。將上述收集的MVs用PKH2

6、6染料標記后與正常HSF共孵育，觀察HSF對MVs的攝取情況;倒置顯微鏡下觀察旁觀者細胞形態(tài)，細胞計數(shù)CCK-8法及EDU染色法檢測旁觀者細胞增殖率。ROS檢測試劑盒檢測旁觀者細胞的氧化損傷，使用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測旁觀者細胞的早期凋亡，膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)/碘化丙啶(PI)雙染法流式細胞儀檢測旁觀者細胞的凋亡率。
　　結果：
　　1.中長波紫外線輻射誘導人皮膚成纖維細胞微囊泡的生成及鑒定
　　中長波紫

7、外線輻射誘導生成的MVs明顯高于正常成纖維細胞的釋放量。透射電鏡結果示MVs是一種膜性微囊結構，圓形或橢圓形，有完整的包膜，腔內(nèi)為低電子密度成分;光散射分析技術提示紫外線輻射后誘導生成的MVs的直徑多聚集在150-300nm，而正常HSF分泌的MVs直徑多在120-200nm，且輻射后HSF分泌的MVs高于正常HSF所分泌的數(shù)量;BCA蛋白定量結果示，紫外線輻射后HSF上清液中MVs在輻射后24h-48h間有一個分泌高峰，而正常細胞在不

8、同時間點分泌MVs的數(shù)量相對恒定;WB結果提示紫外線輻射組誘導生成的MVs，其表面蛋白Alix、tsg101及CD9表達陽性，顯著表達Alix。
　　2急性中長波紫外線輻射誘導生成的微囊泡對人皮膚成纖維細胞形態(tài)、增殖活性、氧化損害及凋亡的影響
　　PKH26熒光標記的MVs在加入培養(yǎng)基30min后即可被旁觀者HSF攝取，在共孵育的48h內(nèi)，細胞核周邊聚集的MVs逐漸增多。紫外線輻射誘導生成的MVs較正常HSF分泌的MVs被旁

9、觀者細胞攝取速度更快。旁觀者細胞與紫外線輻射誘導生成的MVs共孵育后，倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)較多的細胞碎片，細胞體積變大，過度伸展;CCK-8結果提示旁觀者HSF增殖減緩;EDU染色法提示出現(xiàn)旁觀者細胞周期阻滯，S期細胞增多;ROS結果提示，旁觀者細胞活性氧熒光強度高于未輻射組;線粒體膜電位結果提示旁觀者HSF表現(xiàn)為出現(xiàn)較多的細胞碎片，并出現(xiàn)較多綠色熒光，表明細胞出現(xiàn)早期凋亡;AV/PI雙染法結果提示旁觀者HSF表現(xiàn)出凋亡率升高;而細胞的