新型自殺基因Linamarase-Linamarin系統(tǒng)對肝癌體外殺傷效應及其旁觀者效應的初步觀察研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在建立能夠穩(wěn)定表達外緣基因linamarase的HepG2/lis和SMMC/lis肝癌細胞株，進而研究新型自殺基因lis/lin系統(tǒng)對肝癌的體外殺傷效應及旁觀者效應。
　　方法：
　　1、通過電穿孔法將重組質粒pEGFP-N1-lis和質粒pEGFP-N1轉染入人肝癌細胞株HepG2和SMMC7721中，通過G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴大培養(yǎng)，獲得HepG2/lis、HepG2/EGFP、S

2、MMC/lis和SMMC/EGFP細胞，通過熒光顯微鏡進行觀察，RT-PCR法進行表達鑒定。
　　2、繪制基因修飾細胞生長曲線，觀察細胞生長特性有無改變；MTT法觀察高濃度lin對正常肝癌細胞HepG2和SMMC7721的細胞毒性；MTT法觀察不同濃度下lin在不同時間點對HepG2/lis、HepG2/EGFP、SMMC/lis和SMMC/EGFP的細胞毒性。
　　3、通過將不同比例的基因修飾細胞和正常細胞相混合，給與li

3、n作用后，觀察lis/lin自殺基因系統(tǒng)的旁觀者效應。
　　結果：
　　1、成功獲得穩(wěn)定表達lis基因的HepG2/lis和SMMC/lis細胞，熒光顯微鏡下觀察有明顯的lis-EGFP融合蛋白表達，RT-PCR鑒定證明lis基因在mRNA水平有明顯表達。
　　2、通過比較基因修飾細胞的生長曲線，證明lis基因對細胞的增殖生長沒有影響；高濃度的lin對未進行基因修飾的肝癌細胞沒有細胞毒性；低濃度lin對HepG2/li

4、s及SMMC/lis細胞具有明顯的細胞毒作用，即lin（100～1000mg/L）處理HepG2/lis和SMMC/lis細胞2～4天，可殺死大部分細胞。
　　3、旁觀者效應研究顯示僅10％左右的HepG2/lis細胞與HepG2細胞混合培養(yǎng)于lin濃度為500mg/L的培養(yǎng)基時，即可殺死幾乎全部的細胞，顯示出強大的旁觀者效應。
　　結論：
　　1、lis/lin自殺基因系統(tǒng)在體外對肝癌細胞具有明顯的殺傷作用。