新型自殺基因linamarase介導(dǎo)的酶—前藥體系高效靶向治療原發(fā)性肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一,目前尚無(wú)根治方法。自殺基因療法，又名基因介導(dǎo)的酶-前藥療法，能特異性提高藥物在腫瘤中的濃度，并具備獨(dú)特的旁觀者效應(yīng)，是腫瘤基因治療的重要方法之一。本研究將木薯來(lái)源的linamarase（lis）引入肝癌基因治療中，利用其水解前體藥物linamarin（lin），并產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物HCN的特性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷。通過(guò)建立lis穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞周期等特性并無(wú)影響。此外單獨(dú)

2、使用前體藥物lin也未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，從而提示了該策略的安全性。為提高目的基因的表達(dá)及針對(duì)肝癌的靶向性，我們以ViraPower?病毒載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建CMV及AFP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lis腺病毒載體。體外實(shí)驗(yàn)表明，含CMV啟動(dòng)子的腺病毒聯(lián)合lin具備針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大抑制效應(yīng)及旁觀者效應(yīng)。而含AFP啟動(dòng)子的病毒僅具備對(duì)AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的特異性殺傷，從而體現(xiàn)了其針對(duì)肝癌的特異性和靶向性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示lis能特異性表達(dá)于肝癌組織中，聯(lián)

3、合使用lin后能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間。結(jié)果表明，lis/lin系統(tǒng)是一種潛在的肝癌基因治療策略，值得進(jìn)一步深入研究。
　　目的：
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染lis基因的肝癌細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)lis酶在真核細(xì)胞中的活性表達(dá)，觀察它對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)、體外生物學(xué)特性的影響。初步了解lis基因及l(fā)in對(duì)肝癌細(xì)胞的作用；
　　2.運(yùn)用ViraPower?腺病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄下的lis重組腺病毒載體，觀察該病毒載

4、體的感染效率及目的基因表達(dá)情況。應(yīng)用重組病毒聯(lián)合前體藥物lin進(jìn)行多種腫瘤細(xì)胞系的體內(nèi)、體外治療，探討腺病毒載體介導(dǎo)的lis/lin系統(tǒng)的抑瘤效果及作用機(jī)理；
　　3.克隆AFP啟動(dòng)子，檢測(cè)其靶向轉(zhuǎn)錄活性。構(gòu)建AFP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lis重組腺病毒，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)及裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)該病毒前藥體系針對(duì)AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的特異性殺傷，實(shí)現(xiàn)lis/lin系統(tǒng)治療原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)錄水平上的靶向調(diào)控。
　　方法：
　　1.PCR法從木薯

5、cDNA中克隆并擴(kuò)增liscDNA，將該基因亞克隆至pcDNA3.1+質(zhì)粒中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及藥物篩選相結(jié)合，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染lis肝癌細(xì)胞系HepG2/lis。觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，生長(zhǎng)曲線，流氏細(xì)胞周期，裸鼠體內(nèi)成瘤曲線等，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞內(nèi)lis酶活性分析。用不同濃度的lin培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，觀察lin本身對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及細(xì)胞毒性；
　　2.將liscDNA亞克隆于ViraPower?腺病毒載體系

6、統(tǒng)的入門(mén)克隆pENTRTM2B中，利用特異性LR反應(yīng)將入門(mén)克隆中的lis導(dǎo)入腺病毒骨架載體pAd/CMV/V5-DEST中（含CMV啟動(dòng)子）,獲得重組病毒骨架載體pAd/CMV/lis。線性化骨架載體并轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝重組腺病毒Ad-CMV-lis。擴(kuò)增并純化重組腺病毒，TCID50法測(cè)定它的滴度。利用含報(bào)告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染腫瘤細(xì)胞，摸索病毒的最佳感染復(fù)數(shù)。通過(guò)聯(lián)合Ad-CMV-lis及前藥lin進(jìn)行多種腫瘤

7、細(xì)胞系的體外及體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，觀查該系統(tǒng)的抑瘤活性及旁觀者效應(yīng)。用DNA片段化檢測(cè)、Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析、瘤組織病理學(xué)及TUNEL染色進(jìn)一步探索lis/lin系統(tǒng)的抑瘤機(jī)理。
　　3.RT-PCR法從HepG2（AFP+）細(xì)胞基因組中克隆并擴(kuò)增AFP啟動(dòng)子，亞克隆入pEGFP-1質(zhì)粒中，利用報(bào)告基因EGFP檢測(cè)其特異性轉(zhuǎn)錄活性。用AFP啟動(dòng)子替換pcDNA3.1+質(zhì)粒中的CMV啟動(dòng)子，然后將liscDNA插入該質(zhì)粒多

8、克隆位點(diǎn)中，實(shí)現(xiàn)AFP啟動(dòng)子與lis的串聯(lián)。通過(guò)構(gòu)建病毒入門(mén)載體及LR反應(yīng)，將AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架載體中(不含啟動(dòng)子)，獲得骨架載體pAd/AFP/lis。將其轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝重組腺病毒Ad-AFP-lis。重組病毒經(jīng)擴(kuò)增、純化后，聯(lián)合lin進(jìn)行體內(nèi)、體外抑瘤實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該體系對(duì)AFP陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的特異性及靶向性殺傷。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建lis穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系HepG2/l

9、is。發(fā)現(xiàn)它與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照細(xì)胞相比，在細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞周期分布，體內(nèi)成瘤生長(zhǎng)曲線等方面差異不顯著（P＞0.05）。HepG2/lis細(xì)胞給予lin后，能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物HCN，并隨lin濃度的增加而增多，提示lis酶在真核細(xì)胞中能以活性方式表達(dá)。此外單獨(dú)使用lin對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)抑制作用。
　　2.成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-CMV-lis。聯(lián)合應(yīng)用lin后能在體內(nèi)、體外有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑瘤作用與lin呈明顯的

10、時(shí)間、劑量依賴(lài)效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞治療后經(jīng)DNA片段化檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)典型的凋亡DNAladder,Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析提示經(jīng)治療后凋亡及壞死細(xì)胞均增高，但以壞死細(xì)胞增高為主。瘤組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)Ad-CMV-lis/lin治療組中出現(xiàn)大量的壞死區(qū)，并發(fā)現(xiàn)較多的TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞。
　　3.克隆并重組了276bp的AFP啟動(dòng)子。EGFP報(bào)告基因分析提示，該啟動(dòng)子具備AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄活性。成功構(gòu)建AFP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)

11、錄下的重組腺病毒Ad-AFP-lis，實(shí)現(xiàn)了lis在AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞系中的高效特異性表達(dá)。體外及動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)均證明，該病毒聯(lián)合lin治療，能特異性抑制AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間，而對(duì)AFP陰性肝癌細(xì)胞系無(wú)殺傷效果。
　　結(jié)論：
　　1.植物來(lái)源的liscDNA能穩(wěn)定表達(dá)于真核細(xì)胞中，并能正確包裝出類(lèi)似大小，具備β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。liscDNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定整合對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、細(xì)胞周期

12、、成瘤性等生物學(xué)特點(diǎn)并無(wú)明顯影響。而前體藥物lin對(duì)細(xì)胞也具有低毒性，因此lis/lin系統(tǒng)是一種安全的自殺基因治療策略。
　　2.通過(guò)重組腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)腺病毒具有靶細(xì)胞感染率及目的基因表達(dá)水平高，包裝使用方便，病毒滴度高，不整合到宿主基因組中等優(yōu)點(diǎn)，因此能作為lis/lin自殺基因治療的高效表達(dá)載體。
　　3.重組腺病毒Ad-CMV-lis在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的抑制作用，提示lis/lin自殺基因系統(tǒng)具備