原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)屬于常見腫瘤，主要發(fā)生于亞洲和撒哈拉以南非洲地區(qū)，其中約半數(shù)發(fā)生于中國。肝癌預(yù)后很差，即使根治術(shù)后5年生存率僅17％-53％，而且復(fù)發(fā)率很高。每年新發(fā)病例數(shù)與同年死亡病例數(shù)接近。造成肝癌預(yù)后差的原因主要有兩個(gè)：其一是肝癌對常規(guī)的化療幾乎無效；其二是現(xiàn)有的肝癌早期診斷指標(biāo)存在不足，超過80％的患者就診時(shí)處于進(jìn)展期或失去手術(shù)切除機(jī)會。肝癌是多基因參與、多步驟發(fā)生的過程。但是目前對肝癌發(fā)生、發(fā)展中參與基因的了解還很有限，

2、研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因?qū)﹃U明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制具有非常重要的意義，對肝癌發(fā)生相關(guān)基因的深入了解能夠?yàn)閷ふ覞撛诘脑缙谠\斷和預(yù)后標(biāo)記及篩選治療靶點(diǎn)提供有用的信息和依據(jù)。 在本課題中，我們使用抑制性差減雜交結(jié)合芯片方法鑒定人肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因，鑒于對人體肝癌研究只能針對某一階段，而對動物肝癌模型的研究可以系統(tǒng)分析肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的全基因組表達(dá)譜改變，因此，我們使用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)方法建立了大鼠肝癌模型，結(jié)合Affymetri

3、x基因芯片技術(shù)得到了模型大鼠從肝硬化至肝轉(zhuǎn)移階段的差異表達(dá)基因譜。在上述工作基礎(chǔ)上，本研究從中選取了一條在四個(gè)階段都高表達(dá)的基因(Fn14)進(jìn)行了在肝癌細(xì)胞中的功能初步探討，得到了一些有意義的結(jié)果。 第一部分抑制性差減雜交結(jié)合cDNA芯片方法篩選 人肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)的分子遺傳學(xué)背景目前并不完全清楚。在本課題中，我們使用抑制性差減雜交方法(SSH)結(jié)合cDNA芯片分析技術(shù)分離和鑒定肝細(xì)胞肝癌中的

4、差異基因表達(dá)譜，鑒定肝癌組織與癌旁非腫瘤組織差異表達(dá)已知基因45條，其中26條為肝癌組織表達(dá)上調(diào)基因，19條為肝癌組織表達(dá)下調(diào)基因。這些已知基因表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)廣泛的生物學(xué)功能，參與眾多生物學(xué)過程，諸如蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和生物合成、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝、細(xì)胞增殖、信號傳導(dǎo)等。此外，還發(fā)現(xiàn)參與丙酮醛解毒的谷胱甘肽結(jié)合蛋白GLO1表達(dá)增高以及上調(diào)前列腺素E(2)合成的酶PLA2G10在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)的下調(diào)基因中大多數(shù)合成肝臟特異性

5、蛋白(纖維蛋白原、補(bǔ)體、淀粉樣蛋白、白蛋白、觸珠蛋白、血紅素蛋白和a-酸性粘蛋白)。參與生物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞色素家族成員在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)。一些基因編碼產(chǎn)物是酶如醇脫氫酶(ADHlC)、醛脫氫酶(ALDH6A1)、醛縮酶(ALDOB)、精氨酸酶(Arginase)和酯酶(CES1)。同時(shí)，我們也分離到鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zip14)和功能未知基因ZBTB11(Zinc fingerand BTB domain containing 11)在肝癌組織中

6、表達(dá)下調(diào)。在肝癌組織中有7條未知EST與數(shù)據(jù)庫中序列沒有同源性。通過應(yīng)用SSH結(jié)合cDNA芯片技術(shù)我們分離鑒定了一些肝癌相關(guān)基因，其中一些既往沒有相關(guān)報(bào)道。對這些基因的深入研究為了解肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供有用的信息。 第二部分大鼠肝癌模型發(fā)生過程中全基因表達(dá)譜的分析 為了系統(tǒng)分析肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中全基因表達(dá)譜改變，了解其中起重要作用的基因，應(yīng)用DEN誘導(dǎo)方法建立了大鼠肝癌模型，大鼠模型肝臟病變經(jīng)過肝臟非特異性生損傷、

7、肝臟纖維化和硬化、異型增生結(jié)節(jié)和肝癌形成和轉(zhuǎn)移階段。選取正常大鼠肝組織、肝硬化組織(誘癌第12周)、異型增生結(jié)節(jié)(第14周)、肝癌結(jié)節(jié)(第16周)以及肺轉(zhuǎn)移大鼠的肝癌組織(第20周)進(jìn)行Affymetrix基因芯片檢測。差異基因表達(dá)譜結(jié)果顯示，肝硬化組織(12周)上調(diào)基因681個(gè)，下調(diào)基因687個(gè)；異型增生結(jié)節(jié)(14周)上調(diào)基因857個(gè)，下調(diào)基因732個(gè)；肝癌結(jié)節(jié)(16周)上調(diào)基因1223個(gè)，下調(diào)基因1016個(gè)；肝癌轉(zhuǎn)移階段(20周)上

8、調(diào)基因999個(gè)，下調(diào)基因906個(gè)。四個(gè)階段共同上調(diào)基因349個(gè)，其中已知基因246個(gè)；共同下調(diào)基因345個(gè)，其中已知基因215個(gè)，剩余為推測基因、轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和完全未知基因。我們選取部分差異表達(dá)基因通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)證實(shí)了基因芯片結(jié)果的可靠性。差異表達(dá)基因參與眾多的生物學(xué)過程和分子功能，包括物質(zhì)代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、血管生成等。一些差異表達(dá)基因與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。因此認(rèn)為，在肝炎、纖維化

9、和硬化及其相應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)為肝癌發(fā)生、發(fā)展提供了多種細(xì)胞因子組成的微環(huán)境，眾多相關(guān)基因改變造成細(xì)胞增殖和凋亡之間的不平衡，同時(shí)新生血管形成旺盛，因而肝癌發(fā)生并逐漸演進(jìn)。通過系統(tǒng)分析模型大鼠肝癌發(fā)生過程中的基因表達(dá)譜改變，發(fā)現(xiàn)了肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用的差異表達(dá)基因，而且許多基因和肝癌的相關(guān)性是既往沒有報(bào)道的，這些差異基因的發(fā)現(xiàn)為尋找肝癌診斷和預(yù)后的候選分子和篩選治療靶點(diǎn)提供了有用的信

10、息和基礎(chǔ)。 第三部分 Fn14在肝癌細(xì)胞中功能的初步探討 Fnl4基因是在模型組大鼠肝硬化組織(12周)、異型增生結(jié)節(jié)(14周)、早期肝癌結(jié)節(jié)和肺轉(zhuǎn)移大鼠肝癌結(jié)節(jié)(20周)中均高表達(dá)的基因之一。本實(shí)驗(yàn)探討Fnl4對肝癌細(xì)胞凋亡和存活的影響及分子機(jī)制。建立Fn14過表達(dá)細(xì)胞模型，細(xì)胞核熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，MTT方法分析細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fn14高表達(dá)提高肝癌細(xì)胞存活率：TRAIL處理pcDNA3.1-Fn1

11、4轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活抑制率11.82％vsTRAIL處理pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活抑制率29.69％(p<0.05)，抵抗TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡：TRAIL處理后pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率24.17％vsTRAIL處理后pcDNA3.1-Fn14轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率8.55％。進(jìn)一步機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n14高表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞存活和抵抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡是部分依賴于NF-κB活性的：NF-κB活性抑制劑預(yù)處理pcDNA3.1-Fn14轉(zhuǎn)染細(xì)

12、胞后再經(jīng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞存活抑制率29.64％vs不經(jīng)NF-κB活性抑制劑預(yù)處理的pcDNA3.1-Fn14轉(zhuǎn)染細(xì)胞直接’TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞存活抑制率11.82％(p<0.05)；NF-κB活性抑制劑預(yù)處理pcDNA3.1-Fn14轉(zhuǎn)染細(xì)胞再經(jīng)TRAIL誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率19.65％vs不經(jīng)NF-κB活性抑制劑預(yù)處理pcDNA3.1-Fn14轉(zhuǎn)染細(xì)胞直接TRAIL，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率9.82％。因此認(rèn)為Fnl4提高肝癌細(xì)胞存活和抵抗細(xì)胞毒性