DNMT3A基因與肝癌發(fā)生發(fā)展相關性的研究.pdf

1、DNA甲基轉移酶3A(DNAmethyltransferase3A,DNMT3A)作為重新甲基轉移酶在生物個體發(fā)育過程中起DNA甲基化修飾作用,并以表觀遺傳的方式調控基因的表達。近年來研究表明,DNMT3A在多種正常組織中呈不同程度的廣泛性低表達,但在多種腫瘤組織中呈異常高表達模式。我國肝癌組織中DNMT3A表達模式及其與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系尚不清楚,對這一問題的探討和研究將有助子揭示肝癌發(fā)生的表觀遺傳學機制。
　　 本研究應用R

2、eal-time quantitive PCR、免疫組織化學、Western blot等方法分析了肝癌組織及肝癌細胞系中DNMT3A的表達情況及表達部位,以了解DNMT3 A在肝癌中的表達模式及其與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關性。應用RNA干擾(RNAinterfering RNAi)的方法特異性抑制了肝癌細胞及癌旁細胞中DNMT3A的表達,分別應用Cell Counting Kit-8(CCK)、軟瓊脂克隆形成實驗以及流式細胞儀技術檢測DNMT

3、3A沉默后對肝癌細胞增殖能力、克隆形成能力以及細胞周期的影響,以了解DNMT3A通過影響肝癌細胞的哪些生物學行為與功能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。應用基因芯片高通量分析DNMT3A在肝癌中可能調控的基因,并以Real-time PCR驗證,以PTEN基因為目標基因研究DNMT3A對抑癌基因的調控機制,應用MSP(Methylated Specific PCR,MSP)和亞硫酸氫鹽測序(BisulriteSequencing,BGS)的方法檢測P

4、TEN基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)和甲基化程度,探討DNMT3A調控腫瘤抑制基因表達的可能機制。研究結果表明:
　　 1.肝癌中DNMT3A在RNA水平存在表達升高現(xiàn)象,高表達率為64％。石蠟組織切片免疫組化結果顯示DNMT3A在癌旁組織和肝癌組織中的表達部位主要為細胞漿。
　　 2.與正常肝細胞系相比,癌旁細胞系和肝癌細胞系中DNMT3A的表達呈不同程度的異常高表達,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus

5、,HBV)X基因(HBx)的體外轉染上調了癌旁細胞系QSG-7701中DNMT3A的表達水平。
　　 3.RNAi抑制了肝癌細胞SMMC-7721中DNMT3A的表達,影響了肝癌細胞的生長、抑制了肝癌細胞克隆形成的能力。
　　 4.基因芯片結果顯示,DNMT3A表達抑制導致了153個基因表達上調,26個基因表達下調。通過生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn),71%的上調基因5'端存在CpG島,在此CpG島序列中存在近80種潛在的轉錄因

6、子結合位點。
　　 5.肝癌中PTEN存在表達降低現(xiàn)象,去甲基化藥物5-雜氮胞苷處理肝癌細胞系SMMC-7721,發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達上調。
　　 6.MSP的結果顯示,DNMT3A表達抑制后PTEN基因啟動子區(qū)的DNA修飾由甲基化狀態(tài)轉變?yōu)槲醇谆癄顟B(tài),BGS與MSP一致,顯示DNMT3A表達抑制使PTEN基因啟動子區(qū)6個CG位點均出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。
　　 以上研究結果提示,DNMT3A在肝癌組織及肝癌細胞系中