Ezrin異常表達(dá)與散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：探討膜．細(xì)胞骨架連接蛋白埃茲蛋白(Ezrin)對(duì)體外腸癌細(xì)胞株生長和侵襲能力的影響；研究散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中Ezrin蛋白及mgNA水平的表達(dá)；探討Ezrin在散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響；探討Ezrin與CD44的相關(guān)性及二者在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移預(yù)后中的作用。 方法：(1)選取腸癌細(xì)胞株(Lovo，SW480)作為研究材料，采用小干擾RNA(siRNA)方法下調(diào)Ezrin的表達(dá)，分別通過TaqMan實(shí)

2、時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，Real-time qRT-PCR)(相對(duì)定量法)和Western印跡驗(yàn)證siRNA對(duì)．Ezrin在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的下調(diào)及下調(diào)作用隨干擾時(shí)間的變化，根據(jù)Western blotting的結(jié)果選取Ezrin蛋白表達(dá)最低的時(shí)間點(diǎn)，檢測干擾后腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。CCK

3、-8法檢測兩細(xì)胞株干擾前后增殖能力的改變；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2004-2005年間132例結(jié)直腸癌(其中有轉(zhuǎn)移74例，無轉(zhuǎn)移58例)及43例癌旁正常粘膜石蠟包埋組織，通過免疫組化方法檢測Ezrin蛋白和CD44表達(dá)，將二者與患者的臨床病理參數(shù)和預(yù)后及二者的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)Real-time qRT-PCR檢

4、測上述病例對(duì)應(yīng)的新鮮標(biāo)本中Ezrin mRNA含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Ezrin mRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移、Ezrin蛋白表達(dá)部位、臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果：(1)Real-time qRT-PCR和Western blotting顯示Ezrin siRNA對(duì)Ezrin在基因和蛋白水平均有顯著的下調(diào)作用。下調(diào)Ezrin蛋白后可顯著減慢兩株腸癌細(xì)胞的生長速度，S期細(xì)胞比例略有下降，G1期細(xì)胞比例略有上升(Lovo：S期由3

5、3.26％下降到27.81％，G1期由58.55％上升至63.68％；SW480：S期由38.08％下降到34.85％，G1期由37.64％上升至52.80％，P>0.05)。凋亡指數(shù)增加(Lovo由4.89％上升至15.25％，SW480由6.12％上升至12.45％，P<0.01)。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力下降，穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Lovo：由70.20±4.259個(gè)降至17.80±2.223個(gè)，P<0.01；SW480

6、由32.00±2.324個(gè)降至11.40±1.030個(gè)，P<0.01)。(2)Ezrin在正常腸上皮細(xì)胞主要定位于胞漿。在腸癌細(xì)胞也主要定位于胞漿，部分病例以胞膜表達(dá)為主。Ezrin在結(jié)直腸癌中的總陽性率顯著高于癌旁正常腸粘膜的陽性率(79.5％vs 11.6％，P<0.001)。Ezrin總陽性率在轉(zhuǎn)移組高于未轉(zhuǎn)移組(86.5％ vs 70.7％，P=0.026)，其中膜為主型Ezrin表達(dá)率轉(zhuǎn)移組顯著高于未轉(zhuǎn)移組(31.1％ vs

7、6.90,4，P<0.001)，漿為主型Ezrin表達(dá)率轉(zhuǎn)移組(55.4％)與未轉(zhuǎn)移組(63.8％)無明顯差異。Ezrin總陽性率與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)生部位、分化程度、浸潤深度等臨床病理參數(shù)均無關(guān)(P>0.05)。右半結(jié)腸膜為主型Ezrin表達(dá)率顯著高于左半結(jié)腸和直腸(P<0.01)，左半結(jié)腸漿為主型Ezrin表達(dá)率顯著高于右半結(jié)腸和直腸(P<0.01)，Ezrin表達(dá)部位是否與結(jié)腸癌發(fā)生部位相關(guān)仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步

8、研究。單因素生存分析顯示Ezrin蛋白過表達(dá)、Ezrin膜表達(dá)均與患者低無病生存率相關(guān)(P<,單><0.05)。(3)結(jié)直腸癌組織中Ezrin mRNA含量(2.2498±0.6159)顯著高于癌旁正常粘膜的含量(1.8208±0.4896)(P<0.001)。轉(zhuǎn)移組Ezrin mRNA含量(2.3580±0.5584)高于未轉(zhuǎn)移組(2.1129±0.6625)(P=0.037)。Ezrin蛋白陽性組Ezrin mRNA含量(2.263

9、1±0.6278)高于Ezrin蛋白陰性組(2.1960±0.5758)，膜為主型Ezrin mRNA(2.2671±0.5990)略高于漿為主型組mRNA(2.2448±0.6241)(P>0.05)?；颊吣挲g小于50歲組Ezrin mRNA含量(2.5165±0.5755)高于年齡大于50歲組(2.1762±0.6094)(P=0.016)。Ezrin mRNA與性別、腫瘤大小、發(fā)生部位、分化程度、浸潤深度等均無關(guān)(P>0.05)。

10、單因素生存分析顯示Ezrin mRNA高表達(dá)組患者無病生存率(80.77％)略低于Ezrin mRNAf氐表達(dá)組(81.82％)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<,單>>0.05)。(4)CD44在轉(zhuǎn)移組中的陽性率(71.6％)高于未轉(zhuǎn)移組(53.4％)(P=0.031)；CD44和Ezrin的共表達(dá)率轉(zhuǎn)移組(63.5％)高于未轉(zhuǎn)移組(43.1％)(P=0.019)。二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)具有相關(guān)性(P=0.020)，且呈正相關(guān)(r=0.202)。

11、CD44與患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、分化程度、浸潤深度等臨床病理參數(shù)無關(guān)(P>0.05)。單因素生存分析顯示CD44陽性及二者共表達(dá)均與患者的無病生存率相關(guān)(P<,單><0.05)；但多因素生存分析顯示CD44和Ezrin共表達(dá)并不能作為獨(dú)立的預(yù)后影響因素(P<,多>>0.05)。 結(jié)論：(1)靶向抑制Ezrin在腸癌細(xì)胞株的表達(dá)后，腸癌細(xì)胞的生長和侵襲能力都受到相應(yīng)的抑制，Ezrin在腸癌細(xì)胞生長和侵襲過程中發(fā)揮重要的

12、作用。(2)Ezrin蛋白、mRNA表達(dá)增高與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Ezrin蛋白、mRNA水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。Ezrin從胞漿到胞膜的移位在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能起著至關(guān)重要的作用；Ezrin mRNA可能與患者的年齡相關(guān)。(3)Ezrin蛋白及其表達(dá)部位可能成為臨床判斷散發(fā)性結(jié)直腸癌預(yù)后的重要參考指標(biāo)，Ezrin有可能成為抑制腸癌發(fā)生發(fā)展作用的新的靶點(diǎn)。(4)CD44和Ezrin的表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CD44與Ezri