ICOS mir-SNP與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及其機制的初步研究.pdf

1、本文對ICOS miR--SNP與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及其機制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：ICOS miR-SNP與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究。
　　目的：探討ICOS基因3'-UTR內(nèi)的miR-SNP與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。
　　方法：⑴運用生物信息學(xué)軟件篩選出位于ICOS基因3'-UTR內(nèi)的SNP位點及可能存在的miRNA結(jié)合位點;選擇位于預(yù)測的miRNA結(jié)合位點內(nèi)的，且較小等位基因頻率(MA

2、F)大于10％的SNP進(jìn)行研究。⑵收集382例結(jié)直腸癌患者及714例正常人的外周血樣本，從中提取DNA，通過高通量SNP基因分型來檢測SNP的基因型分布。⑶分析不同基因型與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果：①從SNP數(shù)據(jù)庫中找到符合條件的SNP有:rs10183087、rs4404254、rs1559931和rs4675379;能與之結(jié)合的miRNA分別有:rs10183087位點位于miR-587和miR-318

3、0-5p的結(jié)合靶點內(nèi);rs4404254位點位于miR-186-5p、miR-520d-5p、miR-524-5p、 miR-548b-3p、miR-1276和miR-3133的結(jié)合靶點內(nèi);rs1559931位點位于miR-587、miR-1279和miR-3692-3p的結(jié)合靶點內(nèi);rs4675379位點位于miR-182-3p、miR-323b-5p、miR-2117、miR-2355-3p和miR-4279的結(jié)合靶點內(nèi)。②成功檢測

4、到基因型分布的SNP有:rs4404254T＞C，rs1559931G＞A和rs4675379 G＞C。③數(shù)據(jù)分析顯示，在結(jié)直腸癌患者中， rs4404254的CC型純合子所占比例明顯低于占主導(dǎo)地位的TT型純合子(0.8％ vs2.1％;OR=0.35)，而TC雜合子(21.3％vs27.6％; OR=0.70)和C等位基因攜帶者(22.1％ vs29.7％; OR=0.58)所占比例同樣明顯低于TT型純合子。rs1559931的AA純

5、合子所占比例明顯低于占主導(dǎo)地位的GG型純合子(1.1％ vs2.2％;OR=0.46)，而GA雜合子(21.0％ vs27.2％; OR=0.70)和A等位基因攜帶者(22.1％ vs29.4％; OR=0.60)所占比例明顯低于GG型純合子。與GG純合子相較，rs4675379的A等位基因攜帶者在患者組中明顯少見(18.0％ vs22.0％; OR=0.66)。ICOS miR-SNPs與結(jié)直腸癌的臨床病理參數(shù)間無相關(guān)性。
　　

6、結(jié)論：SNP位點rs4404254、rs1559931和rs4675379與結(jié)直腸癌的發(fā)生顯著相關(guān)，其C等位基因，A等位基因和C等位基因可能是結(jié)直腸癌的保護(hù)性因素。
　　第二部分：ICOS miR-SNP對ICOS表達(dá)調(diào)控機制的研究。
　　目的：研究ICOS基因3'-UTR上的SNP位點對miRNA的調(diào)控作用。
　　方法：⑴構(gòu)建野生型ICOS/3'-UTR/pGL3重組熒光素酶表達(dá)載體和突變型ICOS/3'-UTR/p

7、GL3重組熒光素酶表達(dá)載體:(rs4404254 CC型、rs1559931AA型和rs4675379 CC型)。⑵將構(gòu)建好的載體和各自相對應(yīng)miRNA共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定基因活性。⑶運用統(tǒng)計學(xué)軟件分析各SNP位點對miRNA的調(diào)控作用。⑷通過western blot進(jìn)一步驗證miR-SNP對于miRNA的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：rs4404254 T等位基因特異性的ICOS/3'-UTR/pGL3載體的表

8、達(dá)被miR-186-5p顯著抑制(p=0.0072)。rs1559931G等位基因特異性的ICOS/3'-UTR/pGL3載體的表達(dá)能被miR-1279(p=0.0026)和miR-3692-3p(p=0.0023)顯著抑制。rs4675379 C等位基因特異性的ICOS/3'-UTR/pGL3載體的表達(dá)能被miR-323b-5p(p=8.27×105)顯著抑制;而rs4675379 G等位基因特異性的ICOS/3'-UTR/pGL3載