線粒體DNA ATPase 6，8基因突變與大鼠酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：酒精性肝病是由于長期大量飲酒引起的肝臟病變，在西方國家較多見。近年來隨著我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，酒精性肝病的發(fā)病率在我國呈明顯的上升趨勢。過量飲酒不僅可引起酒精性肝病，而且還會導(dǎo)致一系列社會和心理問題。根據(jù)病情和病程，酒精性肝病可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等階段。自從Addsion和Rokitansky分別于1836年和1849年報(bào)道了酒精與肝臟脂肪代謝的關(guān)系，初步提

2、出了酒精性肝病(ALD)的概念以后，國內(nèi)外眾多學(xué)者對酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制從許多方面進(jìn)行了深入的研究，大致包括：化學(xué)反應(yīng)與藥理學(xué)機(jī)制；細(xì)胞因子和免疫學(xué)及病毒學(xué)機(jī)制；遺傳學(xué)機(jī)制；營養(yǎng)學(xué)機(jī)制等。 過量飲酒可使線粒體的呼吸鏈功能亢進(jìn)而促使誘生活性氧，活性氧又可損傷線粒體DNA(mtDNA)而引起堿基序列改變，蓄積的異常線粒體DNA可因呼吸鏈功能障礙而致活性氧溢出增多，導(dǎo)致基因突變和發(fā)生凋亡<'[1]>。 現(xiàn)在，越來越多的證據(jù)表明

3、線粒體是氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡的重要通路。線粒體是細(xì)胞的能量庫。正常情況下，機(jī)體通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP提供機(jī)體所需的能量。 線粒體DNA(mtDNA)是存在于細(xì)胞內(nèi)的、除細(xì)胞核DNA(nDNA)外的唯一遺傳物質(zhì)。近年來線粒體DNA突變與某些疾病的關(guān)系研究進(jìn)展迅速，備受人們的關(guān)注。但線粒體DNA突變引起的線粒體呼吸鏈功能異常、細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生異常是否與酒精性肝病的發(fā)生有著直接的關(guān)系 未見報(bào)道。目的：從基因水平、細(xì)胞器水平

4、對線粒體DNA ATP酶6，8基因突變與酒精性肝病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系進(jìn)行探討，從一個新的角度對酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行有益的研究，以期揭示線粒體DNA突變可能導(dǎo)致的細(xì)胞能量代謝障礙以及由此引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂、細(xì)胞壞死或凋亡與酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，為臨床防治酒精性肝病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 首先應(yīng)用酒精灌胃加橄欖油平衡飲食的建模方式，分別建立大鼠酒精性脂肪肝組、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化組動物模型，并設(shè)對照組，

5、進(jìn)行肝臟組織學(xué)觀察。造模成功后，分別留取各組動物血液、肝臟標(biāo)本，迅速液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增線粒體DNAATPase 6,8基因，PCR產(chǎn)物純化、檢測后，送Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。然后與NCBI blast網(wǎng)站提供的ATPase 6,8基因序列核對，判定有無基因突變及突變類型。以生物發(fā)光法分別測定三組肝組織中ATP含量，判定ATPase 6,8基因突變對肝細(xì)胞內(nèi)ATP能量合成的影響

6、，以及由此可能引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝障礙、脂質(zhì)儲積，引發(fā)酒精性肝病。 結(jié)果： 經(jīng)光鏡和電鏡觀察證實(shí)，本研究成功建立起大鼠酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化三個不同病理階段的動物模型。經(jīng)PCR擴(kuò)增三個模型組肝細(xì)胞線粒體：DNA ATPase 6,8亞基基因并測序后發(fā)現(xiàn)，A17Pase 6亞基基因發(fā)生2處突變，即T8151C和C8300T，且突變檢出率隨造摸時間延長和病程進(jìn)展而明顯提高，對照組未檢出突變。大鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP含量隨

7、造摸時間延長和病變進(jìn)展而明顯降低。提示線粒體DNA ATPase 6,8亞基基因突變與酒精性肝病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。 結(jié)論 1．本研究采用橄欖油平衡飲食加酒精灌胃的方法成功建立了酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化的大鼠模型。該造模方法簡便、費(fèi)用適中，模型穩(wěn)定，是研究酒精性肝病的理想動物模型。 2．造模早期肝細(xì)胞線粒體便出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，提示酒精對線粒體的損傷進(jìn)而影響了線粒體的功能，可能為酒精性肝病發(fā)生的重

8、要機(jī)制之一。 3．在酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞線粒體DNA ATPase 6亞基基因發(fā)現(xiàn)兩處基因突變，即T8151C和C8300T，均為點(diǎn)突變；基因突變檢出率隨造模時間的延長和酒精性肝病病變的加重而明顯增高，提示持續(xù)過量的酒精攝入可造成肝細(xì)胞線粒體DNA ATPase6亞基基因突變，而后者可能參與了酒精性肝病的發(fā)生與發(fā)展。 4．酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP含量隨造模時間延長和酒精性肝病病變的加重而明顯降低，提示肝細(xì)胞線粒體