酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的基因組學和蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、背景與目的：
　　酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長期過量飲酒所致的肝損傷，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化三種主要病理類型。隨著人們飲酒量的增加，ALD的發(fā)病率有逐年增長趨勢。2011年美國男性和女性ALD的患病率分別為7.4％、4.0％。ALD在俄國的發(fā)生率約為5％。我國雖然缺乏大規(guī)模的流行病學數(shù)據(jù)，但據(jù)統(tǒng)計，ALD已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。2000年浙江省ALD流行病

2、學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人群患病率為4.34％。
　　ALD是一種遺傳-行為-環(huán)境相互作用的慢性疾病，其發(fā)病機制非常復雜，包括乙醇及其衍生物的代謝、營養(yǎng)失衡、免疫因素、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、缺氧、炎癥介質(zhì)、自噬與凋亡、基因多態(tài)性、microRNA和表觀遺傳學等。但這些詮釋尚未涵蓋所有的發(fā)病機制，ALD發(fā)生發(fā)展過程中復雜的分子事件直接導致了各種針對ALD的治療措施收效不顯。因此，深入研究其發(fā)病機制對指導本病的防治和提高患者的生活質(zhì)量意義深遠。<

3、br>　　本實驗在成功構建ALD動物模型的基礎上，分析了ALD發(fā)生發(fā)展過程中肝臟基因和蛋白質(zhì)表達譜的動態(tài)變化，以期為認識ALD發(fā)生發(fā)展機制提供新線索。
　　方法：
　　首先，用酒精給大鼠連續(xù)灌胃1月和3月，觀察肝臟病理變化。其次，采用基因芯片技術，對酒精性脂肪肝組、酒精性肝炎組和正常對照組大鼠肝臟基因表達變化進行兩兩比較分析，并應用分子注釋系統(tǒng)(MAS)進行基因本體(GO)功能注釋和Pathway(KEGG和GenMAPP)

4、分析。第三，應用雙向熒光差異凝膠電泳(2D DIGE)技術分析不同病理狀態(tài)的模型組和對照組大鼠肝臟蛋白質(zhì)表達譜的差異，所得到的差異蛋白質(zhì)點經(jīng)質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)進行檢測以鑒定差異蛋白，并結合生物信息學手段對差異蛋白進行功能分析和相互作用網(wǎng)絡分析。
　　結果：
　　動物實驗觀察到了肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤、壞死，與人類酒精性脂肪肝和酒精性肝炎的病理表現(xiàn)相似。
　　基因組學研究方面，分別篩選出顯著差異表

5、達的基因285個（酒精性脂肪肝組與正常對照組比較）、318個（酒精性肝炎組和正常對照組比較）。兩種病理狀態(tài)的大鼠在肝臟基因的表達上無顯著的統(tǒng)計學差異。這些差異基因主要參與了氧化還原、各種代謝（包括脂質(zhì)、乙酰輔酶A、β-內(nèi)酰胺類抗生素、谷氨酸鹽、氨基酸、碳水化合物）、細胞分化及凋亡、補體激活等200多種生理過程和分子功能，以及近百條信號通路。通過分析及比較，發(fā)現(xiàn)了一些具有明顯階段特異性的差異基因，它們分別參與了不同的代謝途徑。H2-T3，

6、Aldh1l1，Pklr等基因在酒精性脂肪肝階段上調(diào);同階段下調(diào)的基因有:Pla2g12a，Hes1，Gcnt2，Adh4等。Coq6，Idi1，F(xiàn)dps，Ppox，Gck，Npas2，Ddhd1等基因在酒精性肝炎階段上調(diào);同階段下調(diào)的基因有:C7，Alas2，Got1，Aoc3，Vcam1，Mmp2，G6pc等。這些基因可能因作用于不同的代謝途徑而導致了不同的病理改變。其中，大部分基因罕見報道。值得關注的是，Pla2g12a基因參與了

7、VEGF, MAPK等多條信號通路，而MAPK信號通路又通過細胞色素P4504a8基因與PPAR信號通路有著聯(lián)系。Pla2g12a基因如何受VEGF信號轉導通路的調(diào)控，其引起酒精性脂肪肝發(fā)生的機制尚待深入研究。
　　此外，差異基因相互作用網(wǎng)絡圖分析發(fā)現(xiàn)了位于網(wǎng)絡中心的關鍵節(jié)點基因周期素D1(Ccnd1)。我們還從參與ALD發(fā)病機制的信號通路中選擇了PPAR、胰島素、MAPK、粘著斑和P53這5條信號通路，并挑選這些通路中的37個基

8、因進行了熒光定量PCR驗證，驗證結果與芯片檢測結果一致。其中，脂肪酸合成酶基因(Fasn)和肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A基因(Cpt1a)的表達量隨ALD病程的進展分別持續(xù)增強和減弱。
　　蛋白組學研究方面，共鑒定了49個差異蛋白。除去冗余蛋白，酒精性脂肪肝和酒精性肝炎兩個病理階段的差異蛋白共35個。它們分別與三大物質(zhì)的代謝、尿素合成、脂肪酸β氧化、細胞骨架、免疫防御、電子轉移、細胞交通、ATP結合、抗氧化等功能有關。其中，8個蛋白的

9、表達水平在酒精性脂肪肝和酒精性肝炎階段均明顯上調(diào)，分別是:碳酸酐酶3、谷胱甘肽轉移酶Mu1和Mu2、衰老標記蛋白、電子轉移黃素蛋白亞單位α、腺苷高半胱氨酸酶、類甘油醛-3-磷酸脫氫酶和過氧化氫酶(catalase，CAT)。而ATP合成酶亞單位d和β肌動蛋白FE-3的表達水平在這兩階段均明顯下調(diào)。提示這些蛋白可能與ALD的發(fā)生發(fā)展有關。尤其是CAT，在應用Genomatix軟件分析差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡后，發(fā)現(xiàn)它處于網(wǎng)絡的中心，故推測這

10、些差異蛋白可能因為影響了CAT而最終導致了ALD。綜合文獻報道，我們認為衰老標記蛋白可以作為診斷ALD的生物學標志物，它可能系通過胰島素代謝途徑而影響了ALD的發(fā)生發(fā)展。另一發(fā)現(xiàn)是，谷胱甘肽轉移酶Mu1在ALD發(fā)展過程中的表達量穩(wěn)步上升，間接反映了ALD發(fā)生發(fā)展過程中氧化應激水平的不斷加重。
　　結論：
　　1.成功地構建了ALD大鼠模型;
　　2.發(fā)現(xiàn)了一些階段特異性的代謝途徑和差異基因，其中Pla2g12a基因及其