非酒精性脂肪性肝病機(jī)制及標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliver—disease，NAFLD)已經(jīng)成為一種常見的慢性肝病，其發(fā)病率逐年上升。它包括單純性脂肪肝(simplesteatosis，SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化。脂肪肝是一種良性疾病，而NASH卻可進(jìn)一步發(fā)展、惡化成為終末期肝病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。目前NAFLD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今仍尚不清楚，認(rèn)為與氧化應(yīng)

2、激的增加、線粒體損傷和脂肪因子等因素相關(guān)，但對導(dǎo)致進(jìn)行性肝細(xì)胞損傷的機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門研究機(jī)體特定條件下功能狀態(tài)的前沿技術(shù)，更貼近機(jī)體已經(jīng)或正在發(fā)生的行為和功能狀態(tài)，可為疾病診斷和治療提供大量的理論和實(shí)驗依據(jù)。同時，肝活檢是一種損傷性的檢測方法，而且取得的肝組織樣本也不足于大規(guī)模的篩選差異蛋白質(zhì)。因此，本研究以蛋氨酸和膽堿缺乏(methionineandcholinedeficient，MCD)飲食誘導(dǎo)的NAFLD小

3、鼠模型為研究對象，采用差異凝膠電泳(dimensionaldifferencegelelectrophoresis，DIGE)技術(shù)篩選出與NAFLD密切相關(guān)的肝臟差異蛋白質(zhì)譜，結(jié)合生物信息學(xué)手段系統(tǒng)的分析了差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出重要的節(jié)點(diǎn)分子進(jìn)行了驗證，從而為深入探討NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時本研究還采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析(serologicalproteomeanalysis，SERPA)技術(shù)篩選出與NA

4、FLD密切相關(guān)的自身抗原譜，為挖掘NAFLD潛在的血清標(biāo)志物而提供了理論依據(jù)。 我們分別用正常飲食與MCD飲食飼養(yǎng)小鼠，并在MCD飼養(yǎng)后的2、5、8周，成功復(fù)制出不同病變程度的NAFLD動物模型(單純性脂肪肝(SS)，脂肪性肝炎(NASH)及NASH伴早期肝纖維化。我們采用DIGE技術(shù)分析了不同造模時間的正常組和模型組小鼠肝臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，并用MALDI—TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的檢測，共鑒定了189個差異蛋白。

5、其中SS階段的差異蛋白58個，NASH階段的差異蛋白82個，NASH伴早期肝纖維化階段的差異蛋白162個。這些差異蛋白多數(shù)存在于線粒體(52.2％)，其次為細(xì)胞外區(qū)域(13.4％)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(10.4％)、細(xì)胞漿(9.0％)、細(xì)胞核(9.0％)、過氧化物酶體(4.5％)和未知定位(1.5％)。通過差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，我們發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD病程的進(jìn)展，參與清除氧自由基相關(guān)酶、脂肪酸β氧化的相關(guān)酶及糖異生相關(guān)酶的表達(dá)逐漸降低，而脂肪

6、形成相關(guān)酶和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)逐漸升高。同時，在NASH伴早期肝纖維化階段，星狀細(xì)胞標(biāo)志蛋白結(jié)蛋白(desmin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的表達(dá)明顯增加，表明NAFLD病程向肝纖維化進(jìn)一步惡化。 最為顯著的是脂肪代謝紊亂始終貫穿NAFLD的發(fā)生發(fā)展，特別是對NASH伴早期肝纖維化階段差異蛋白的IPA分析，我們發(fā)現(xiàn)兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，分別是Akt/PKB通路和p3

7、8MAPK通路。首先，我們在NAFLD模型中，從蛋白水平和mRNA水平驗證了DIGE實(shí)驗結(jié)果的可靠性；其次，采用Westernblot技術(shù)檢測到NASH伴早期肝纖維化階段肝組織pho—Akt和pho—p38的表達(dá)明顯增加。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，通過模擬胰島素樣作用和加重炎癥反應(yīng)得到人們的廣泛關(guān)注。因此，我們采用免疫組化技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測到Visfatin不僅在NASH伴早期肝纖維化肝組織中表達(dá)

8、明顯增加，而且在其血清中也明顯增高，因此我們認(rèn)為Visfatin通過激活A(yù)kt/PKB和p38MAPK通路，加重肝細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積和肝組織炎癥反應(yīng)，從而在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 與此同時，我們又采用SERPA技術(shù)篩選出18個與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)的自身抗原，通過對自身抗原α—烯醇酶(α—enolase，ENOA)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶3(Proteindisulfideisomeraseassociated3，PD