非酒精性脂肪性肝病模型中鋅指蛋白A20的表達(dá)、作用機(jī)制研究及藥物干預(yù).pdf

1、第一部分游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變模型中鋅指蛋白A20的表達(dá)及作用機(jī)制
　　目的：探討游離脂肪酸（FFAs）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變模型中A20的表達(dá)及其作用機(jī)制。
　　方法：以不同濃度混合FFAs（油酸：軟脂酸=2:1）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，MTS法測(cè)定細(xì)胞活力，油紅O染色鑒定脂肪沉積，并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量，篩出合適的干預(yù)濃度。免疫印跡法檢測(cè)A20、pIκB、p65p表達(dá)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞上清中IL-

2、8的含量。
　　結(jié)果：0.125-0.5mM FFAs對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯抑制作用，1.0、2.0mM FFAs對(duì)細(xì)胞毒性較大。與對(duì)照組相比，油紅O染色后可見細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴，在0.125～0.5mM FFAs范圍內(nèi)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，染色脂質(zhì)增多，且細(xì)胞內(nèi)TG含量增加（P<0.05），1.0、2.0mM FFAs作用24h時(shí)細(xì)胞浮起死亡較多，染色脂質(zhì)減少，TG含量下降，故選擇0.25或0.5mM作為干預(yù)濃度。隨著FFAs濃

3、度增高，A20表達(dá)在6 h呈增加趨勢(shì)，而12 h、24 h時(shí)A20表達(dá)呈先減少后增加的趨勢(shì)，0.5 mmol/L是分界點(diǎn)。當(dāng)0.5mM FFAs干預(yù)時(shí)，A20、pIκB、p65p在4h、6h時(shí)表達(dá)明顯增加，相應(yīng)的細(xì)胞上清中IL-8含量明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：FFAs能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞鋅指蛋白A20表達(dá)，可能是通過激活NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分沉默人A20基因?qū)χ咀僅epG2細(xì)胞的影響
　

4、　目的：構(gòu)建人A20基因缺陷穩(wěn)定細(xì)胞系，探討A20表達(dá)對(duì)脂肪變HepG2細(xì)胞的影響。
　　方法：根據(jù)人A20基因mRNA序列設(shè)計(jì)并合成3條互補(bǔ)的DNA單鏈寡核苷酸，分別為sh1、sh2、sh3，重組到pGIPZ慢病毒載體，形成慢病毒真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成慢病毒。將此慢病毒感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)過puromycin篩選后，免疫印跡法鑒定A20表達(dá)。經(jīng)0.5mM FFAs干預(yù)最佳穩(wěn)定細(xì)胞系后，免疫印跡法鑒定A20表

5、達(dá)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-8的含量。
　　結(jié)果：目的序列成功插入pGIPZ慢病毒載體并包裝成高滴度的慢病毒，三條序列均能抑制A20表達(dá)，其中sh3的抑制率最高，選為后續(xù)最佳沉默穩(wěn)定細(xì)胞系。與對(duì)照組相比，A20缺陷后 IL-8分泌顯著增加（P<0.05），細(xì)胞內(nèi) TG含量無差別（P>0.05）。當(dāng)0.5mM FFAs干預(yù)后，A20的表達(dá)呈現(xiàn)瞬時(shí)性，在1、4、6h表達(dá)增強(qiáng)，IL-8和TG水平均明顯增高（P<

6、0.05）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建人A20基因缺陷穩(wěn)定細(xì)胞系。沉默A20可促進(jìn)HepG2細(xì)胞炎癥因子IL-8分泌，增加脂肪沉積，A20對(duì)肝細(xì)胞可能具有保護(hù)作用，為NAFLD的防治提供潛在的靶點(diǎn)。
　　第三部分非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型中A20的表達(dá)
　　目的：建立蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型，探討該模型中A20的表達(dá)。方法：將18只6周齡、雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（

7、n=8）、MCD飲食組（n=10），分別給予普通飼料、MCD飲食，喂養(yǎng)6周后處死，分別取脂肪組織稱重、肝臟組織行組織學(xué)鑒定和勻漿處理，并檢測(cè)血清中FFA、ALT、AST、TG、TC和肝組織勻漿中FFA、TG、TC含量及血清炎癥因子表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)肝組織A20的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，MCD組體重、肝指數(shù)、脂肪指數(shù)明顯下降（P<0.01），組織病理切片HE染色可見明顯脂肪變、氣球樣變、小葉炎癥，測(cè)得血清中ALT、AST升高（P<0.

8、01），TG、TC下降（P<0.01）；IL-6升高（P<0.05），而FFA、MCP-1、IFN-γ未見明顯變化（P>0.05）；肝內(nèi)FFA升高（P<0.01），TG、TC無明顯差異（P>0.05），免疫印跡可見MCD組A20表達(dá)呈現(xiàn)雙條帶，而對(duì)照組只出現(xiàn)單條帶，半定量后MCD組比對(duì)照組 A20的表達(dá)顯著增高（P<0.01）；結(jié)論：在MCD飲食成功誘導(dǎo)的NASH模型中，小鼠肝組織內(nèi)A20表達(dá)明顯增高，A20對(duì)肝組織可能具有保護(hù)作用。<

9、br>　　第四部分藥物干預(yù)對(duì)非酒精性脂肪性肝病模型中A20表達(dá)的影響
　　目的：姜黃素和多烯磷脂酰膽堿（PPC）分別干預(yù)NAFLD體內(nèi)、外模型，觀察A20的變化。方法：1.用不同濃度的姜黃素、PPC分別預(yù)刺激HepG2細(xì)胞24h，再分別與0.25mM FFAs共孵育HepG2細(xì)胞6h，免疫印跡法檢測(cè)A20表達(dá)，并測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞上清中IL-8、細(xì)胞內(nèi)TG的含量；2.將38只6周齡、雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MCD組、姜黃素

10、組、PPC組，除對(duì)照組8只外，其余各組均為10只，對(duì)照組給予普通飼料、其余組給予 MCD飲食，喂養(yǎng)1周后藥物組按姜黃素（1000mg/kg）、PPC（912mg/kg）0.1ml/10g每天灌胃一次處理，對(duì)照組和 MCD組給予同等劑量生理鹽水，6周后全部處死，分別取脂肪組織稱重，肝臟組織行HE染色鑒定和組織勻漿，并檢測(cè)血清中FFA、ALT、AST、TG、TC和肝組織勻漿中FFA、TG、TC含量及血清炎癥因子表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)肝組織A2

11、0的表達(dá)。結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，0.25mM FFAs組 A20表達(dá)增加，且細(xì)胞上清中 IL-8和TG含量增加（P<0.05）；與0.25mM FFAs組相比，20、25μmmol/L姜黃素混合組A20表達(dá)明顯受抑制，而80、160μmmol/L PPC混合組A20表達(dá)明顯增加，但細(xì)胞上清中IL-8和TG含量均下降（P<0.05）。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與MCD組相比，藥物組循環(huán)中炎癥因子均無顯著差異（P>0.05）；姜黃素組肝

12、指數(shù)高于MCD組（P<0.01），但脂肪指數(shù)卻相反，甚至低于對(duì)照組（P<0.01）；與MCD組比較，姜黃素血清中FFA降低（P<0.01），ALT、AST、TG、TC無改善作用（P>0.05），肝組織內(nèi)FFA比對(duì)照組高（P<0.01），TG、TC均無顯著差異（P>0.05）；PPC組的肝指數(shù)比MCD組、對(duì)照組均低（P<0.01），脂肪指數(shù)低于對(duì)照組（P<0.01）；與MCD組比較，PPC組血清中FFA、ALT降低（P<0.05），而TC

13、高于MCD組（P<0.01），但比對(duì)照組低（P<0.01），TG比對(duì)照組低（P<0.01），肝組織內(nèi)FFA比對(duì)照組高（P<0.01），TC高于MCD組（P<0.01），TG均無顯著差異（P>0.05）。HE染色見姜黃素組肝內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集明顯減少，脂肪變性得到改善；肝組織內(nèi)A20的表達(dá)量比MCD組要顯著減少（P<0.05），但是仍呈現(xiàn)雙條帶。PPC組肝內(nèi)炎癥細(xì)胞顯著減少，脂肪變性不明顯，小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壞死較少；肝組織內(nèi)A20表達(dá)比MC