升降散對(duì)大鼠非酒精性脂肪性肝病的干預(yù)研究.pdf

1、本文從以下兩部分進(jìn)行了闡述：
　　第一部分 升降散對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病的作用研究
　　目的:觀察中藥復(fù)方升降散對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的干預(yù)作用并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:隨機(jī)抽取36只雄性SD大鼠中的12只作為正常對(duì)照組，給予基礎(chǔ)飲食，剩余的作為高脂飲食組，給予高脂飲食（79％基礎(chǔ)飼料+10％蛋黃粉+

2、10％豬油+1％膽固醇），于造模4周末，每組隨機(jī)處死6只，取肝組織行蘇木素-伊紅染色(HE染色)和油紅O染色，觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況進(jìn)行造模評(píng)估。建模成功后，除正常對(duì)照組(normal control group，NOR)外，將高脂飲食組大鼠隨機(jī)分為模型組(nonalcoholic fatty liver disease group，NAFLD)、升降散組(sheng jiang san group，SJS)和非諾貝特組(fenofib

3、rategroup，F(xiàn)NBT)，每組6只，其中SJS組予以升降散（免煎劑:僵蠶225 mg/kg/d，蟬蛻104 mg/kg/d，姜黃375 mg/kg/d，大黃333 mg/kg/d）灌胃，F(xiàn)NBT組予以非諾貝特混懸液(100 mg/kg/d)灌胃，NOR組和NAFLD組予以等體積生理鹽水灌胃，1次/天，連續(xù)4周，整個(gè)造模及給藥期間，觀察大鼠體重、活動(dòng)度、攝食等一般情況;給藥4周末處死所有大鼠，測定血清甘油三酯(triglycerid

4、e，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，AST)含量和新鮮肝組織勻漿液中的TG、TC水平;取肝組織行HE和油紅O染色，觀察肝臟脂肪變性等組織學(xué)改變;免疫組化檢測肝組織磷酸化的AMP依賴的蛋白激酶α（Phosphorylated AMP-activatedprotein k

5、inase alpha，p-AMPKα）表達(dá)情況;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肝組織AMPKα、p-AMPKα、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin，mTOR)、p-mTOR的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.一般情況:與NOR組比較，NAFLD模型組大鼠活動(dòng)度降低，反應(yīng)稍遲緩，體重顯著性增加(P＜0.05);藥物干預(yù)后，大鼠活動(dòng)度和反應(yīng)性一定程度改善，體重明顯下降(P＜0.0

6、5);2.脂質(zhì)水平與肝臟病理改變:與NOR組比較，NAFLD組血清TG水平升高(P＜0.05)，肝臟的TG、TC含量顯著升高(P＜0.01)，肝索排列結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫大，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，出現(xiàn)嚴(yán)重的肝脂肪變性;藥物干預(yù)后，SJS組的血清TG水平和肝臟的TG、TC含量均顯著降低(P＜0.05)，肝索恢復(fù)放射狀排列結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞大小正常，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)明顯減少，肝脂肪變性明顯改善，F(xiàn)NBT組以上指標(biāo)亦出現(xiàn)不同程度恢復(fù);3.作用機(jī)制

7、:與NOR組比較，NAFLD組肝組織的p-AMPKα蛋白水平明顯降低，p-mTOR蛋白水平明顯升高;藥物干預(yù)后，SJS組肝組織的p-AMPKα表達(dá)顯著上調(diào)，p-mTOR則明顯下降，F(xiàn)NBT組的p-AMPKα蛋白水平顯著上調(diào)，p-mTOR蛋白水平無明顯改變。
　　結(jié)論:1.升降散可改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病的血脂和肝脂肪變性，具有顯著的治療作用;2.升降散可能通過調(diào)控AMPK/mTOR通路，抑制脂類合成和減輕肝臟脂質(zhì)沉

8、積而發(fā)揮抗NAFLD作用。
　　第二部分 升降散對(duì)基于肝臟Pten基因下調(diào)誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病的作用研究
　　目的:采用CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated proteins，常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白）技術(shù)，通過尾靜脈注射pX330-Pten質(zhì)粒減少大鼠肝臟P

9、ten(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物)基因表達(dá)，建立非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型，并觀察升降散對(duì)基于肝臟Pten基因下調(diào)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型的作用。
　　方法:1.NAFLD大鼠模型所需的最佳pX330-Pten劑量和造模時(shí)間:將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(normal contro

10、lgroup,NOR)、pX330載體組(pX330 vector group,VECTOR)、pX330-Pten低劑量組(pX330-Pten low-dose group，LD)、pX330-Pten中劑量組(pX330-Pten medium-dose group，MD)、pX330-Pten高劑量組（pX330-Ptenhigh-dose group，HD），每組12只，LD組、MD組、HD組大鼠分別予以一次性尾靜脈注射75

11、ug/100g、150 ug/100g、300 ug/100g的pX330-Pten質(zhì)粒，VECTOR組予以注射150 ug/100g pX330空載體，NOR組予以注射等體積生理鹽水，注射體積為10 ml，在30秒內(nèi)完成注射。注射后6周、9周末每組分別處死6只大鼠，測定血清TG、TC、ALT、AST的含量;取肝組織行HE染色和油紅O染色，觀察肝臟脂肪變性等組織學(xué)改變;取新鮮肝組織提取DNA，行高通量測序，測定肝臟基因組DNA中Pten

12、基因的突變頻率;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Quantitative Real-time ReverseTranscription PCR，q-RT-PCR)檢測肝組織Pten的mRNA水平;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肝組織Pten、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylatedprotein kinase B，p-Akt)蛋白水平;2.研究升降散對(duì)基于肝臟Pten基因下調(diào)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠的作用:將24只雄性SD大

13、鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NOR)，模型組(pX330-Pten)，升降散組(SJS)，非諾貝特組(FNBT)，每組6只，pX330-Pten組、SJS組、FNBT組均予以尾靜脈注射300 ug/100gpX330-Pten質(zhì)粒，NOR組予以注射等體積生理鹽水，注射體積為10 ml，在30秒內(nèi)完成注射。注射后6周末，SJS組予以升降散（免煎劑:僵蠶225mg/kg/d，蟬蛻104 mg/kg/d，姜黃375 mg/kg/d，大黃333 mg

14、/kg/d）灌胃，F(xiàn)NBT組予以非諾貝特混懸液(100 mg/kg/d)灌胃，NOR組和pX330-Pten組予以等體積生理鹽水灌胃，1次/天，連續(xù)4周，實(shí)驗(yàn)期間，觀察大鼠體重、活動(dòng)度、攝食等一般情況;給藥4周末處死所有大鼠，測定血清TG、TC、ALT、AST水平;行HE染色和油紅O染色，觀察大鼠肝臟病理改變。
　　結(jié)果:1.NAFLD大鼠模型的建立:與NOR組比較，隨著pX330-Pten質(zhì)粒劑量和造模時(shí)間的增加，LD組、MD組

15、、HD組出現(xiàn)逐漸加重的肝臟脂質(zhì)沉積，其中高劑量造模6周后，體重和血脂尚未出現(xiàn)明顯改變，但大鼠肝臟出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積，提示此時(shí)己成功建立處于疾病早期的NAFLD大鼠模型;高劑量造模9周后，大鼠體重顯著性增加(P＜0.05)，血清TG顯著升高(P＜0.05)，肝臟出現(xiàn)更加嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積;HD組大鼠肝臟基因組DNA中Pten基因的突變頻率增加，肝組織Pten的mRNA水平和蛋白水平均顯著下調(diào)(P＜0.05)，P-Akt蛋白水平明顯上調(diào)(P＜0.

16、05);2.升降散對(duì)基于肝臟Pten基因下調(diào)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠的作用:與NOR組比較，pX330-Pten組大鼠活動(dòng)度降低，反應(yīng)稍遲緩，體重顯著性增加(P＜0.05)，藥物干預(yù)后，無明顯恢復(fù);在脂質(zhì)水平與肝臟病理方面，與NOR組比較，pX330-Pten組血清TG顯著升高(P＜0.05)，肝臟出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積，藥物干預(yù)后，血清TG水平及肝脂肪變性情況均無明顯改善。
　　結(jié)論:1.基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，通過尾靜脈注射技術(shù)一