木質(zhì)纖維素降解真菌斜臥青霉的比較基因組學(xué)與功能基因組學(xué)研究.pdf

1、利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)液體燃料和化合物是保障人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要替代途徑。在被廣泛接受的技術(shù)路線中，來自真菌的木質(zhì)纖維素降解酶系通常被用來將木質(zhì)纖維素材料水解為可發(fā)酵的糖。然而，目前木質(zhì)纖維素降解酶系的生產(chǎn)水平和水解活性都有待提高。絲狀真菌斜臥青霉（Penicilliumdecumbens）已被用于工業(yè)水平的纖維素酶生產(chǎn)多年，經(jīng)誘變選育的突變株的纖維素酶容積生產(chǎn)率與廣泛使用的纖維素酶生產(chǎn)菌里氏木霉相當(dāng)，且酶系組成更為合理。因此，

2、對(duì)該真菌進(jìn)行深入研究對(duì)降低木質(zhì)纖維素降解酶系的生產(chǎn)成本、認(rèn)識(shí)真菌中木質(zhì)纖維素降解酶的合成調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　 本論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.斜臥青霉野生株114-2的基因組測(cè)序與分析
　　 對(duì)斜臥青霉野生株114-2的基因組序列進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)木質(zhì)纖維素降解酶及其它多個(gè)重要生理過程相關(guān)蛋白進(jìn)行了人工注釋。比較基因組學(xué)分析顯示，斜臥青霉盡管在系統(tǒng)進(jìn)化上與產(chǎn)黃青霉較為接近，卻含有較少的細(xì)胞代謝、調(diào)

3、控相關(guān)蛋白，其功能蛋白數(shù)目與里氏木霉更為接近。相對(duì)于廣泛使用的產(chǎn)纖維素酶真菌里氏木霉，斜臥青霉含有種類、數(shù)量更為豐富的木質(zhì)纖維素降解酶編碼基因，尤其是參與半纖維素降解的蛋白和含纖維素結(jié)合域蛋白的編碼基因。在木質(zhì)纖維素降解酶合成的調(diào)控機(jī)制方面，斜臥青霉與里氏木霉存在一些共性，但基因組角度的分析與功能實(shí)驗(yàn)也顯示二者之間存在若干相關(guān)調(diào)控機(jī)制的差異。此外發(fā)現(xiàn)，斜臥青霉基因組上存在植物細(xì)胞壁降解酶編碼基因密集分布的區(qū)域，部分木質(zhì)纖維素降解酶編碼基

4、因可能來自進(jìn)化中的水平轉(zhuǎn)移、擴(kuò)張事件。
　　 2.斜臥青霉野生株與木質(zhì)纖維素降解酶高產(chǎn)株的比較基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
　　 通過對(duì)斜臥青霉野生菌株114-2和木質(zhì)纖維素降解酶高產(chǎn)突變株JU-A10-S、JU-A10-T進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)野生株114-2與兩株突變株在基因組水平存在大量差異，而兩株突變株之間僅存在少量的序列差異。推測(cè)最早分離的菌株114可能為異核體，且在后續(xù)的菌株分離、誘變選育中得到了純化。對(duì)野生株

5、與突變株之間含有氨基酸序列變異的蛋白的功能分析顯示了轉(zhuǎn)錄因子的富集，為進(jìn)一步研究突變株的木質(zhì)纖維素降解酶高產(chǎn)機(jī)理提供了參考。通過序列比對(duì)，還找到了突變株孢子色素合成能力缺失的可能原因。通過對(duì)野生株與突變株之間比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，確認(rèn)了分泌組學(xué)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了菌株間若干胞內(nèi)生物學(xué)過程表達(dá)水平的差異，為產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶真菌的進(jìn)一步改造指出了方向。此外，確認(rèn)了野生株、突變株以及另一株斜臥青霉Peni-1的交配型屬性，為在斜臥青霉中探索

6、有性雜交提供了可能。
　　 3.斜臥青霉內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶Cel45A與Cel5C的異源表達(dá)與重組酶的性質(zhì)研究
　　 實(shí)現(xiàn)了來自斜臥青霉的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel45A和Cel5C的活性重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種酶水解纖維素的產(chǎn)物均主要為纖維寡糖。與已報(bào)道的多數(shù)真菌來源內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶相比，rCel45A與rCel5C對(duì)CMC-Na的水解活性較低，可能與它們與底物的結(jié)合機(jī)制有關(guān)。與其它GH45家族蛋白類似

7、，rCel45A具有較高的最適作用溫度和較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，有望用于纖維素酶系的改良。此外，通過結(jié)構(gòu)域缺失方法，發(fā)現(xiàn)第447位至655位的氨基酸在Cel5C水解活性的發(fā)揮中具有重要作用，其作用機(jī)制可能與蛋白穩(wěn)定性的保持有關(guān)。
　　 4.斜臥青霉絲氨酸蛋白酶PrtB生物學(xué)功能的初步研究
　　 通過同源蛋白搜索，發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉中參與菌體自溶的幾丁質(zhì)酶ChiB、中性金屬蛋白酶PepJ和內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶EngA在斜臥青霉中均