肺炎克雷伯菌耐藥質(zhì)粒的比較基因組學(xué)研究.pdf

1、我們用肺炎克雷伯菌一個(gè)70，057bp，GC含量為52.3％，含有95個(gè)ORF的環(huán)狀質(zhì)粒pKF3-70與其他質(zhì)粒進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)pKF3-70可以分為5個(gè)主要的區(qū)域：①質(zhì)粒不兼容分配系統(tǒng)；②質(zhì)粒復(fù)制系統(tǒng)；③質(zhì)粒接合系統(tǒng)；④質(zhì)粒轉(zhuǎn)移前導(dǎo)區(qū)；⑤可變區(qū)。 比較基因組學(xué)分析揭示pKF3-70的復(fù)制系統(tǒng)，分配系統(tǒng)，接合系統(tǒng)，前導(dǎo)區(qū)都與大腸桿菌質(zhì)粒R100高度相似，暗示pKF3-70的骨架序列，是從一個(gè)類似R100的質(zhì)粒演化而來

2、。質(zhì)粒pKF3-70復(fù)制區(qū)的必須元件包括一個(gè)149bp的復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，復(fù)制起始蛋白編碼基因repAl及其上游的負(fù)調(diào)節(jié)位點(diǎn)copA和copB(repA2)，pKF3-70復(fù)制區(qū)具有與FⅡ不兼容組R100(也稱NR1)的復(fù)制子區(qū)完全一致的序列，而且這個(gè)復(fù)制系統(tǒng)是pKF3-70上發(fā)現(xiàn)的唯一復(fù)制系統(tǒng)，這意味著pKF3-70，R100，R1具有一樣的復(fù)制機(jī)制，pKF3-70利用反義RNA的機(jī)制實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)控制，復(fù)制方式是具有theta模式

3、的單向復(fù)制；質(zhì)粒pKF3-70的分配系統(tǒng)是一個(gè)長達(dá)1.56 kb的區(qū)域，它的組成元件包括：一段包含十個(gè)重復(fù)單元的正向重復(fù)序列(parC)，及其下游的ORF1和ORF2。這個(gè)區(qū)域與已知的IncFⅡ組質(zhì)粒R1及R100的parA分配系統(tǒng)在序列十分相似，ORF1 and ORF2組成一個(gè)可以共轉(zhuǎn)錄的操縱子。ORF1 and ORF2編碼的蛋白分別是ParM和ParR，ParM具有ATP酶活性而 The ParR可結(jié)合到parC上并借此調(diào)節(jié)啟動(dòng)

4、子活性。pKF3-70的復(fù)制和分配系統(tǒng)都與incFⅡ組的質(zhì)粒R1和R100十分接近，暗示pKF3-70和這兩個(gè)質(zhì)粒很可能是不兼容的。 pKF3-70接合起始區(qū)(OriT)包括切口(nick)位點(diǎn)及附近的接合轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)。PKF3-70的OriT區(qū)分保守區(qū)和非保守區(qū)，非保守區(qū)主要是TraY蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(sby)。該結(jié)合位點(diǎn)非保守性與TraY蛋白序列本身的非保守性有關(guān)聯(lián)，我們發(fā)現(xiàn)TraY只是前24個(gè)氨基酸殘基是非保守的

5、，因此很可能TraY與DNA結(jié)合的蛋白域就處于這前24個(gè)氨基酸殘基中。 我們發(fā)現(xiàn)3個(gè)類F質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移區(qū)幾乎一致，類F質(zhì)粒與類W質(zhì)粒接合系統(tǒng)間的進(jìn)化距離較大的，但它仍比類F質(zhì)粒和類P質(zhì)粒間的距離顯得小。pKF3-70所有的推測基因都能在R100及F質(zhì)粒上找到同源基因。有5個(gè)基因(traC，traG，traI，traD and traX)甚至在不同兼容組的質(zhì)粒上也是保守的，這暗示它們可能參與質(zhì)粒接合系統(tǒng)的基本構(gòu)建。各個(gè)類F接合系統(tǒng)

6、之間比較分析顯示有六個(gè)預(yù)測基因在R100和pKF3-70中都是保守的，但在F質(zhì)粒中卻不保守。ORF22是這六個(gè)預(yù)測基因中最長的ORF，編碼一個(gè)長達(dá)286 aa的假設(shè)蛋白。在它起始位點(diǎn)上游26bp的位置能預(yù)測到一個(gè)啟動(dòng)子，用CD-search可以發(fā)現(xiàn)其序列有一個(gè)磷酸脂酶域，它可能與脂類代謝有關(guān)，但還需進(jìn)一步的研究這個(gè)蛋白在質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移過程當(dāng)中所起的功能；PKF3-70的前導(dǎo)區(qū)長約17.5kb，含有35個(gè)預(yù)測基因。我們發(fā)現(xiàn)前導(dǎo)區(qū)包含一些與質(zhì)

7、粒穩(wěn)定有關(guān)的基因比如一些DNA修飾基因及分離后殺滅基因。與F及R100質(zhì)粒相比，pKF3-70擁有13個(gè)獨(dú)一無二的基因，它們在R100和F中不存在，其中ORF62可以預(yù)測到一個(gè)跨膜域，但具體功能未知。 質(zhì)粒pKF3-70攜有耐藥基因ctx-m-14，ctx-m-14的上游是一個(gè)插入序列ISEcp1，ctx-m-14的下游是一個(gè)截?cái)嗟牟迦胄蛄蠭S903，緊鄰IS903的下游的是一段20 bp反向重復(fù)序列(IRR2)，較之插入序列I

8、SEcp1的右側(cè)反向重復(fù)序列(IRR1)，(IRR2)與插入序列ISEcp1的左側(cè)反向重復(fù)序列(IRL)匹配的更好。我們還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)5bp的正向重復(fù)序列單元正好位于從IRL到IRR2的DNA片段的兩側(cè)翼，這兩個(gè)重復(fù)單元很可能是由轉(zhuǎn)座子的插入產(chǎn)生的目標(biāo)重復(fù)序列，由ISEcp1，ctx-m-14，截?cái)郔S903及IRR2構(gòu)成的區(qū)域極可能是一個(gè)有活性的轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子可以介導(dǎo)了耐藥基因ctx-m-14的水平基因轉(zhuǎn)移。 質(zhì)粒pKF3-70

9、中還有鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，它包括3個(gè)OFF，這3個(gè)ORF組成一個(gè)可以共轉(zhuǎn)錄的操縱子，在ORF4上游50 bp、110 bp、94 bp的位置分別有鐵攝取調(diào)節(jié)子(fur)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)啟動(dòng)子的-35框“TTGACA”及一個(gè)啟動(dòng)子的-10框“TGGCATTAT”，ORF4編碼一個(gè)預(yù)測的胞漿間鐵離子結(jié)合蛋白，ORF5編碼一個(gè)預(yù)測的透性蛋白，其功能是作為鐵離子通道，ORF6編碼預(yù)測的ATP酶，功能是作為整個(gè)鐵離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)自的引擎。eitD(ORF7)

10、基因位于ORF6的下游，它編碼的預(yù)測蛋白功能是能根據(jù)離子功能調(diào)節(jié)一些小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此ORF7進(jìn)一步加強(qiáng)了質(zhì)粒pKF3-70的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能；質(zhì)粒pKF3-70還編碼polⅢ-ε同系物的基因，根據(jù)比較基因組學(xué)研究推測，它可能賦予宿主菌以對紫外線所致突變及自發(fā)突變抵抗能力。pKF3-70獲得這樣一個(gè)基因使得他獲得更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。 總而言之，肺炎克雷伯質(zhì)粒pKF3-70，是一個(gè)R100質(zhì)粒的衍生物，并是一個(gè)可轉(zhuǎn)移的多重耐藥質(zhì)粒