豬肺炎支原體和豬鼻支原體的基因組測(cè)序與比較基因組學(xué)分析.pdf

1、支原體是一類(lèi)缺少細(xì)胞壁的原核微生物，宿主范圍十分廣泛，具有高接觸性、高傳染性和高發(fā)病率的特性，而且對(duì)常用的作用于細(xì)胞壁的抗生素（如β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素等）不敏感，因此臨床控制十分困難。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化程度越來(lái)越高，國(guó)際貿(mào)易日趨頻繁，動(dòng)物支原體的危害也逐漸顯現(xiàn)，并且形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻。由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的豬氣喘病是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病。現(xiàn)已證實(shí)，豬肺炎支原體感染導(dǎo)致

2、豬呼吸道纖毛損傷、脫落，從而引起肺炎。由于缺乏有效的遺傳操作工具，人們對(duì)豬肺炎支原體致病機(jī)制方面的研究還相對(duì)滯后。目前，豬肺炎支原體毒力因子的研究主要集中在粘附因子方面，其中P97蛋白是最早被證實(shí)具有粘附作用的粘附因子，隨后為數(shù)不多的粘附因子如P102、P146、P159和P216等相繼報(bào)道，豬肺炎支原體是否存在其他與致病相關(guān)的毒力因子尚不明確。本研究以具有明晰進(jìn)化歷程的豬肺炎支原體168親本株和疫苗株為切入點(diǎn)，通過(guò)系統(tǒng)的比較基因組學(xué)分

3、析，從核苷酸堿基序列差異、整合性結(jié)合元件、引起基因組全長(zhǎng)差異的因素、代謝途徑差異以及氨基酸水平上的差異對(duì)粘附因子、被膜蛋白、蛋白分泌系統(tǒng)、免疫原性蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響等方面，開(kāi)展了豬肺炎支原體在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中毒力減弱的分子機(jī)制研究，為闡明豬肺炎支原體的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。豬鼻支原體和豬肺炎支原體都被劃分為豬支原體病的病原，但豬鼻支原體卻表現(xiàn)出多樣的寄生方式，具有侵染實(shí)驗(yàn)室多種細(xì)胞（來(lái)源于不同物種）的能力。豬肺炎支原體專(zhuān)性定植

4、于呼吸道，而豬鼻支原體能定位于機(jī)體中多種組織，能在多種疾病的污染物中分離得到，而且有報(bào)道指出豬鼻支原體的長(zhǎng)期感染能夠誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。相對(duì)于豬肺炎支原體，豬鼻支原體表現(xiàn)出了多樣的生活方式，從基因組學(xué)層面剖析豬鼻支原體多樣的生活方式會(huì)加深人們對(duì)豬鼻支原體的了解。本課題主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.豬肺炎支原體、豬鼻支原體的全基因組測(cè)序與生物信息學(xué)分析
　　采用SolexaGenomeAnalyzerⅡx、RocheGSFLX和AB

5、I3730測(cè)序系統(tǒng)相結(jié)合的優(yōu)化方案，分別對(duì)豬肺炎支原體168親本株和疫苗株、豬鼻支原體HUB-1株的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定，并利用Multiplex-PCR和ABISequencing方法填補(bǔ)基因組序列空缺。在完成了全基因組序列的測(cè)定后，通過(guò)基因組ORFs的預(yù)測(cè)、編碼區(qū)起點(diǎn)終點(diǎn)的校正、基因注釋、功能基因分類(lèi)、IS序列等分析，最終繪制了基因組完成圖，其中HUB-1株的全基因組序列是國(guó)際上測(cè)定并公布在GenBank上的第一株豬鼻支原體全基因

6、組序列。
　　根據(jù)豬肺炎支原體的基因組信息，開(kāi)展了基因組共線性分析、IS插入元件分析、膜相關(guān)蛋白分析和代謝分析，發(fā)掘了與病原菌生長(zhǎng)、代謝相關(guān)的基因，重建了豬肺炎支原體的代謝通路，一共包括八大代謝門(mén)類(lèi)，依次分別是核苷酸代謝、糖代謝、聚糖的生物合成和代謝、其它氨基酸的代謝、脂質(zhì)代謝、輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝和能量代謝。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體的碳源和能量主要來(lái)源于糖酵解途徑，而在分析糖酵解途徑時(shí)，豬肺炎支原體不能利用淀粉蔗糖代

7、謝產(chǎn)生的α-D-Glucose-1P，其碳源幾乎全部來(lái)源于外源葡萄糖的攝取。
　　2.豬肺炎支原體親本株、疫苗株的比較基因組學(xué)分析
　　比較基因組學(xué)的分析主要從核苷酸堿基序列差異、整合性結(jié)合元件、引起基因組全長(zhǎng)差異的因素、代謝途徑差異和氨基酸水平上的差異對(duì)粘附因子、被膜蛋白、蛋白分泌系統(tǒng)、免疫原性蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響等方面展開(kāi)。豬肺炎支原體168親本株和疫苗株基因組全長(zhǎng)分別為925576bp和921093bp，兩菌株基因組中

8、基因的組成和順序高度保守。通過(guò)對(duì)核苷酸堿基序列差異的系統(tǒng)分析，最終挖掘到了330個(gè)遺傳變異位點(diǎn)（其中包括227個(gè)SNVs，60個(gè)插入和43個(gè)缺失）。有意義的是，目前國(guó)際上已報(bào)道的豬肺炎支原體毒力相關(guān)基因（如:P97，P102，P146，P159，P216等）和主要免疫原性基因（如:P36，P46，P65等）幾乎全部包含在這330個(gè)遺傳變異位點(diǎn)內(nèi)。深入分析后發(fā)現(xiàn)，P97中的氨基酸突變發(fā)生在串聯(lián)重復(fù)的短肽序列AAKPV/E中，而AAKPV/

9、E功能域被證明與P97的粘附能力密切相關(guān)。P146中的谷氨酰胺的插入發(fā)生在[Q]n[(P/S)Q]m串聯(lián)重復(fù)區(qū)，脯氨酸和谷氨酰胺富集區(qū)會(huì)形成polyprolineⅡhelix的螺旋結(jié)構(gòu)，這一螺旋結(jié)構(gòu)在粘附過(guò)程中也十分重要。P216中四個(gè)氨基酸(polyQ)的缺失位于polyQ的重復(fù)區(qū)域，polyQ功能域在維持P216C端P85片段定位于細(xì)胞表面起著十分重要的作用，而P85具有粘附能力。P159中的錯(cuò)義突變發(fā)生在(S)(S)G(G)S重復(fù)

10、區(qū)域中。
　　進(jìn)一步從氨基酸水平上分析了遺傳變異對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響。支原體擁有最低程度的新陳代謝以及最小的基因組冗余，為了適應(yīng)寄生生活，支原體丟失了許多與代謝相關(guān)的基因，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)給大部分來(lái)源于對(duì)外源物質(zhì)的攝取。與此對(duì)應(yīng)，支原體需要許多轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，豬肺炎支原體有兩套轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng):一種是磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS);一種是ABCtransporter轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在168親本株傳代過(guò)程中并沒(méi)有受到影響。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中MHP168

11、L_394(ABCtransporterpermeaseprotein)和MHP168L_413(ATP-bindingprotein)發(fā)生了突變，而它們?cè)贛hp體內(nèi)感染過(guò)程中的表達(dá)量相對(duì)于體外生長(zhǎng)時(shí)是上調(diào)的，提示MHP168L_394和MHP168L_413在豬肺炎支原體感染的過(guò)程中發(fā)揮著某種作用，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變很可能影響支原體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖。對(duì)168親本株和疫苗株的代謝途徑進(jìn)行了差異分析，經(jīng)鑒定差異基因主要分布在7條代謝通

12、路中，依次分別為糖酵解途徑、嘌呤代謝途徑、嘧啶代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑、氨?；鵷RNA生物合成途徑以及磷酸戊糖途徑。綜上所述，似乎正是這些遺傳變異在粘附、免疫、代謝等功能基因中不斷地積累，造成了基因功能的改變，最終導(dǎo)致了菌株毒力的差異。
　　3.支原體比較基因組學(xué)分析
　　以支原體科20株支原體的完整基因組序列為研究材料，首先通過(guò)BLAST方法進(jìn)行基因預(yù)測(cè)、Inparanoid程序?qū)ふ抑毕低椿驅(qū)Γ⒉捎肨ribeMCL

13、方法完成了20株支原體直系同源群的聚類(lèi)化分析。隨后進(jìn)行了核心基因組學(xué)分析，確定了整個(gè)支原體科的核心基因。結(jié)合核心基因組與已報(bào)道的隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果，系統(tǒng)分析了支原體賴(lài)以生存所必須的保守基因，指出在隨機(jī)轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)中干擾掉的recA、recU、uvrA、uvrB、mutM等基因可能在支原體野外的長(zhǎng)期生存中是必須的，而它們?cè)谵D(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)后短暫的生存能力可能是因?yàn)槠鋵?duì)IS元件插入的暫時(shí)性耐受。通過(guò)對(duì)核心基因組和豬鼻支原體蛋白功能聚類(lèi)的比較分析，發(fā)現(xiàn)

14、支原體中與氨基酸合成、糖類(lèi)運(yùn)輸和防御功能相關(guān)的蛋白急劇減少，指出了支原體在進(jìn)化過(guò)程中功能基因丟失的趨勢(shì)。將支原體的196個(gè)核心基因分別比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果串聯(lián)，根據(jù)串聯(lián)基因的比對(duì)結(jié)果，使用Tree-puzzle，在GTR+gamma+(Ⅰ)模型下進(jìn)行最大相似度擬合，計(jì)算支原體菌株間的距離矩陣，最終繪制了支原體科的超級(jí)進(jìn)化樹(shù)。在進(jìn)化樹(shù)的基礎(chǔ)上，用Branch-Site方法評(píng)估了各分支上支原體在進(jìn)化過(guò)程中自然選擇壓力的分布情況，發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體