豬肺炎支原體對(duì)豬鼻腔樹突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，Mps）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一種高度接觸性、慢性、呼吸道傳染病?；钾i表現(xiàn)為陣發(fā)性的干咳，呼吸困難等臨床癥狀，飼料轉(zhuǎn)換率低，生長(zhǎng)緩慢。我國(guó)Mps的發(fā)病率達(dá)30％～50％，感染率高達(dá)75％，該病的流行性給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Mhp主要定植于豬呼吸道上皮細(xì)胞纖毛，造成纖毛清除功能的損害，和上皮細(xì)胞的

2、炎癥反應(yīng)。呼吸道上皮細(xì)胞下廣泛著樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)，DCs是目前已知的哺乳動(dòng)物功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，在識(shí)別抵抗病原微生物入侵，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)首先對(duì)豬鼻腔DCs的分布進(jìn)行定位，并體外分離豬骨髓源DCs，通過體內(nèi)體外試驗(yàn)驗(yàn)證豬DCs與Mhp的相互作用，探究Mhp對(duì)豬DCs主要免疫功能的影響，為研究Mhp的發(fā)病機(jī)制及Mhp疫苗研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
　　1豬鼻腔及扁桃體

3、樹突狀細(xì)胞的分布研究
　　豬鼻腔和扁桃體是呼吸道最先接觸抗原的部位，在動(dòng)物體抵御病原微生物入侵過程中起重要作用。樹突狀細(xì)胞(DCs)是動(dòng)物體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，能有效的激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)。人和小鼠鼻腔和扁桃體DCs已有研究報(bào)道，但豬鼻腔和扁桃體DCs的表型和分布仍不明確。因此，本試驗(yàn)選用MHCⅡ、CD11b和CD16三種豬DCs特異性抗體，對(duì)10頭2月齡的杜長(zhǎng)大三元雜交豬鼻腔、咽鼓管扁桃體、軟腭扁桃體中的DCs進(jìn)行標(biāo)記，應(yīng)

4、用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)對(duì)分布于豬鼻腔和扁桃體內(nèi)的DCs進(jìn)行觀察乖分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):豬鼻腔、咽鼓管扁桃體和軟腭扁桃體黏膜下固有層分布著CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs;咽鼓管扁桃體和軟腭扁桃體淋巴濾泡內(nèi)也分布著CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs，且扁桃體固有層DCs數(shù)量是淋巴濾泡的3倍;健康狀態(tài)下，豬鼻腔和扁桃體上皮細(xì)胞間DCs幾乎沒有分布;CD11b+DCs多分布于咽鼓管上皮細(xì)

5、胞下方，僅有少量的CD11b+DCs可向上皮細(xì)胞方向伸出胞質(zhì)突起。結(jié)果表明:豬鼻腔和扁桃體內(nèi)分布著一定數(shù)量的CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs，有利于黏膜抗原的攝取和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
　　2豬肺炎支原體對(duì)豬扁桃體和鼻腔樹突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的影響
　　豬支原體肺炎(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是一種傳染性慢性豬呼吸道疾病，日益危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。Mhp是引起豬發(fā)生支原體肺炎

6、的重要病原，飛沫經(jīng)鼻腔傳播是其主要傳播途徑。上呼吸道黏膜免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞(DCs)和淋巴細(xì)胞，作為黏膜重要防線，在Mhp傳播和感染過程中變化還不明確。因此，本研究應(yīng)用熒光抗體雙標(biāo)的方法觀察感染Mhp后鼻腔DCs、淋巴細(xì)胞、分泌型IgA陽(yáng)性細(xì)胞的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):感染Mhp28天后，豬鼻腔CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs數(shù)量較正常對(duì)照組相比明顯減少;鼻腔CD3+T細(xì)胞數(shù)量、分泌型IgA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯較正

7、常對(duì)照組相比明顯減少。結(jié)果表明:豬肺炎支原體感染導(dǎo)致鼻腔免疫細(xì)胞的數(shù)量減少，鼻腔黏膜免疫力下降，進(jìn)而可能激發(fā)其他呼吸道病原微生物的感染。
　　3豬肺炎支原體對(duì)體外培養(yǎng)豬骨髓源DCs免疫功能的影響
　　DCs是機(jī)體唯一能激活幼稚型T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。DCs的成熟和遞呈能力直接影響下游免疫應(yīng)答水平。為了探究Mhp對(duì)DCs免疫功能的影響，

8、本試驗(yàn)首先從仔豬骨髓中分離前體細(xì)胞，加入豬源GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)其分化為DCs，并通過形態(tài)學(xué)、表面分子等對(duì)其進(jìn)行鑒定。隨后，Mhp-168株體外刺激DCs24小時(shí)，一部分DCs經(jīng)流式細(xì)胞儀、定量PCR等方式對(duì)其表面分子的表達(dá)情況和細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);另一部分DCs與異種淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示:Mhp-168株體外刺激DCs組與空白對(duì)照組相比顯著抑制表面分子CD1a的表達(dá)，表面分子CD80/86