豬肺炎支原體SYBR GREEN熒光定量PCR檢測技術(shù)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起豬地方流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumoniae,EP)的病原.傳統(tǒng)的Mhp定量檢測方法主要有顏色變化單位(color change unit.CCU)檢測、菌落形成單位(colony forming unit,CFU)檢測、顯微鏡檢測計數(shù)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等方法.上述方法費(fèi)時費(fèi)

2、力,實驗過程中容易污染,常引起鑒定、計數(shù)失誤,導(dǎo)致試驗結(jié)果具有波動性. 近年來,國內(nèi)外開始利用熒光定量PCR技術(shù)檢測支原體并對支原體進(jìn)行精確定量的研究,但只做到Mhp的定性檢測,仍然沒有解決Mhp定量檢測的難題. 本實驗以GenBank公布的Mhp 232株(ACCESSION No.NC 006360)p110基因、p97基因和p46基因序列作為靶序列,參考J株(ATCC 25934,ACCESSION No.NC 00729

3、5)、7448株 (ACCESSION No.NC_007332)p76基因、p97基因和p46基因序列,設(shè)計合成了多對特異性引物,通過對熒光定量PCR擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線的分析,篩選出符合Mhp熒光定量PCR定量檢測要求的引物p110realF/R:構(gòu)建了含有Mhp p110基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-T1-p110,并建立了以p110(p76)基因序列作為靶序列的Mhp SBYR GREEN熒光定量PCR檢測方法.該方法準(zhǔn)確、

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