用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR方法檢測RHDV、RHDV2的初步研究.pdf

1、兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）對養(yǎng)兔業(yè)來說是一種威脅很大的的烈性傳染性疾病，由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起，主要侵害2月齡以上的青壯年兔，造成的發(fā)病率和病死率都非常高，讓家兔養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟效益大幅降低。從2010年開始，歐洲地區(qū)出現(xiàn)了兔出血癥病毒變異型，又稱兔出血癥病毒2型（Rabbit hemorrhagic disease

2、virus tape2，RHDV2），可造成30日齡以下幼兔和免疫兔瘟家兔的死亡，這一情況引起了養(yǎng)兔業(yè)的廣泛關(guān)注。鑒于兔出血癥病毒出現(xiàn)的變異情況及新的流行趨勢，本試驗通過對比分析RHDV, RHDV2的結(jié)構(gòu)蛋白基因VP60，分別對RHDV,RHDV2的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法進(jìn)行了研究，以期為RHD的快速檢測診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)技術(shù)工具。
　　根據(jù)NCBI上登錄的RHDV2 VP60基因序列設(shè)計

3、6對引物，人工合成靶基因。將靶基因純化回收，通過連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV2。根據(jù)靶基因序列設(shè)計1對簡并引物，以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴增，建立關(guān)于RHDV2的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，并優(yōu)化反應(yīng)體系，進(jìn)行特異性試驗、重復(fù)性試驗和靈敏性試驗。用建立的方法對實驗室人工感染樣品（7份）和臨床采集樣品（15份）進(jìn)行檢測。試驗結(jié)果顯示建立的RHDV2檢測方法靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好。該方法可

4、檢測的重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV2的最低拷貝數(shù)為68個拷貝，該方法只能特異性的擴增RHDV2，對RHDV、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸桿菌和兔健康組織RNA的擴增結(jié)果均呈陰性，以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴增得到的Ct值組內(nèi)變異系數(shù)均小于0.8％，而該方法對RHDV人工感染樣品和15份臨床采集樣品的檢測結(jié)果均為陰性。
　　通過比較分析NCBI上已登錄的兔出血癥病毒VP60基因序列，選擇保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物。提取RHDV陽性病料

5、總RNA進(jìn)行RT-PCR擴增，擴增出979bp大小的RHDV基因片段，并克隆到pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV。同時在擴增區(qū)內(nèi)設(shè)計1對簡并熒光定量PCR引物，目的片段大小為165bp，以pMD19-T-RHDV為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化和特異性試驗、敏感性試驗、重復(fù)性試驗，建立了RHDV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法。再利用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方

6、法對RHDV人工感染家兔（7只）進(jìn)行檢測并分析各組織器官的病毒含量，同時參照文獻(xiàn)中的RT-PCR方法進(jìn)行平行檢測。試驗結(jié)果表明建立的RHDV檢測方法最低可檢測的重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV的拷貝數(shù)為81個拷貝，靈敏度優(yōu)于RT-PCR方法。該方法只能特異性擴增RHDV，pMD19-T-RHDV2、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸桿菌和兔健康組織RNA的擴增均為陰性;以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴增得到的Ct值在組內(nèi)的變異系數(shù)均小于1.12％，說