應用熒光定量RT-PCR法檢測mdr-1基因的表達.pdf

1、[目的]建立用實時熒光定量RT—PCR法在mRNA水平上檢測腫瘤細胞中多藥耐藥基因(mdr-1基因)表達的方法，實現(xiàn)對腫瘤細胞中mdr-1mRNA快速，準確的檢測，對臨床治療和腫瘤預后判斷提供輔助手段。 [材料與方法] 1．細胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPMLl640培養(yǎng)基對乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR于孵箱內單層連續(xù)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰酶及0.25％的EDTA用直接吹打法傳代。 2．細胞和

2、組織總RNA提取：用Biozol試劑分別提取乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR細胞和人乳腺癌腫瘤組織中的總RNA。 3．cDNA的合成：以所提取的乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR及人乳腺癌腫瘤組織所提取的RNA為原料分別進行逆轉錄反應，獲得cDNA。 4．PCR反應及重組質粒的構建：以乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR逆轉錄的cDNA為模板，進行普通PCR擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進行純

3、化。用PGEM—T Easy質粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構建重組質粒。將重組質粒轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，藍白斑篩選重組質粒。 5．熒光定量PCR標準曲線的建立：優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，并以重組質粒為標準品建立檢測mdr-1 mRNA的標準曲線。 6．用所建立的熒光定量PCR方法對58例乳腺癌標本中mdr-1 mRNA的含量進行測定，同時用免疫組化的方法檢測標本中P-gP的表達，兩種方法進行比較，采用X<'

4、2>檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 [結果]構建了mdr-1基因的重組質粒，并且成功轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選提取重組質粒，對質粒進行梯度稀釋，以稀釋的質粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立最佳熒光定量PCR體系，并以已知濃度的質粒為標準品構建了定量測定mdr-1mRNA的標準曲線。對所建立的熒光定量PCR體系進行靈敏度和重復性測定，經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)該PCR反應體系可穩(wěn)定的檢測出40μ1反應體系中1

5、0<'2>拷貝數(shù)的質粒模板。五次重復性實驗中，每次實驗的平均Ct值分別是22.80、22.96、22.73、22.89、22.81，其組內變異系數(shù)分別為0.6％、0.4％、0.5％、0.6％和0.6％，組間變異系數(shù)為0.5％。用此熒光定量PCR方法和免疫組化法分別對58例乳腺癌組織進行檢測，陽性率分別為72.4％和58.6％，兩者相比較結果有顯著性差異(P<0.001)。 [結論]本實驗建立了熒光定量RT-PCR法定量測定腫瘤細