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文檔簡介
1、革蘭氏陰性腸桿菌科肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是醫(yī)源性感染最重要的條件致病菌之一。隨著抗菌素的泛用,多重耐藥性正在它們中廣泛傳播,給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。研究發(fā)現許多與致病和耐藥等相關的基因,可借助接合性質粒、插入序列元件、整合子和基因組島(Genmomic islands)等可移動遺傳元件進行廣泛傳播,這些可移動遺傳元件組成了可移動基因組(mobile genome, or‘mobilome’)。
2、其中,基因組島在細菌的進化機制、致病機理和抗菌素抗性中扮演著重要的角色。目前,基因組島已在多種腸桿菌科細菌中發(fā)現和報道,但對于K. pneumoniae基因組島的研究卻鮮有報道。
本研究通過采用生物信息學工具 MobilomeFINDER,對4株已測序 K. pneumoniae基因組(MGH78578, NTUH-K2044, Kp342 and KCTC2242)中的87個tRNA/tmRNA基因位點進行分析,共識別出8個
3、tRNA/tmRNA基因作為外源DNA片段的插入熱點。采用tRIP-PCR策略考察了36株環(huán)境和臨床分離的K. pneumoniae菌株在這8個插入熱點中基因組島的分布情況,揭示了在不同生態(tài)環(huán)境下K. pneumoniae的遺傳多樣性。通過構建3個位點特異的酵母捕捉載體,并利用酵母同源重組系統(tǒng)成功克隆6個新島(9~36 kb),實現了精確定向克隆K. pneumoniae染色體中大片段DNA的方法,為進一步克隆其它臨床和環(huán)境菌株基因組島
4、奠定了基礎。
同時,本研究對克隆的兩個插入到tmRNA基因位點的新島tmGI_Kpw49和tmGI_Kp35進行了初步的序列和功能分析。從水稻根際分離的K. pneumoniae w49中的一個9.6 kb島 tmGI_Kpw49,生物信息學預測其涉及 L-艾杜糖酸(L-idonate)的分解代謝,該代謝島可能在 w49菌株和植物的共生過程中扮演著重要的角色。從病人傷口分泌物中分離的K. pneumoniae HS04035中
5、的一個36.6 kb島tmGI_Kp35,編碼一個整合到宿主染色體上的P2-like噬菌體。序列比對發(fā)現該類型噬菌體整合在多種已測序腸桿菌科細菌的染色體上。通過文獻收集和生物信息學預測,系統(tǒng)地比較分析了已知和預測的P2-like噬菌體,發(fā)現該類型噬菌體,除含有保守的結構基因外,常攜帶編碼致病因子等重要的特異性基因,表明其在腸桿菌科細菌的致病和遺傳多樣性上扮演著重要的角色。
基于36株環(huán)境和臨床分離的K. pneumoniae菌
6、株的tRIP-PCR篩查結果,本研究對一株臨床分離的泛耐藥K. pneumoniae HS11286菌株進行了全基因組測序。HS11286菌株是2011年初從華山醫(yī)院一病人的痰液中分離的,具有廣譜的耐藥性,屬于碳青霉烯酶產生菌。通過454測序、拼裝和補gaps,獲得了7個環(huán)形的復制子,包含一條染色體和六個質粒。HS11286染色體大小為5,333,942 bp,GC含量為57.5%,注釋出5316個蛋白編碼基因,87個tRNA基因,1個
7、tmRNA基因和8套rRNA操縱子(16S-23S-5S)。通過與已測序的4株K. pneumoniae的模擬消減雜交分析,共識別出422個HS11286菌株特異的基因。進一步在HS11286基因組中識別出9個基因組島,其中7個為前噬菌體,另外2個為整合性接合元件。HS11286菌株中含有6個天然質粒,包括3個為耐藥性質粒(~110 kb),和3個大小為1~4 kb的小質粒。質粒pKPHS1推測為致病相關的整合型質粒,同時編碼β內酰胺酶
8、CTX-M-14。質粒pKPHS2和pKPHS3均為多重抗性質粒,前者攜帶編碼碳青霉烯酶基因 blaKPC-2,是碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制;而后者攜帶約10種重要的抗性基因。同時,兩者都攜帶接合轉移相關的tra基因,可能導致耐藥基因在不同細菌中的轉播。3個小質粒 pKPHS4、pKPHS5和pKPHS6編碼功能未知的蛋白,其中,1.3 kb的質粒pKPHS6是目前肺炎克雷伯中報道的最小質粒。
多重耐藥革蘭氏陰性條件致病菌已
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