磷霉素單用及聯(lián)合對(duì)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的PK-PD和基因組學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　近年來，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升趨勢，給臨床感染治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為解決臨床治療藥物有限的難題，“老藥新用”備受關(guān)注。磷霉素作為“老藥”代表，具有抗菌譜廣、組織滲透性高、安全性良好等特點(diǎn)，且多項(xiàng)研究也證實(shí)其對(duì)多重耐藥菌也具有良好的抗菌活性。然而，磷霉素單藥臨床治療效果不確定且會(huì)產(chǎn)生快速的耐藥現(xiàn)象，因此研究如何合理使用磷霉素治療多重耐藥細(xì)菌感染具有十分重要的臨床價(jià)值。本論文主要通過

2、評(píng)價(jià)磷霉素單用以及與亞胺培南、厄他培南、替加環(huán)素、多粘菌素E和阿米卡星聯(lián)合用藥對(duì)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的體外殺菌效果，并進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)評(píng)估，從中篩選出最優(yōu)給藥方案，以期為臨床應(yīng)用磷霉素治療多重耐藥菌感染提供參考。
　　方法:
　　1.收集來自北京和浙江兩家三甲醫(yī)院排除痰液標(biāo)本的臨床感染非重復(fù)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌170株。產(chǎn)碳青霉烯酶表型確證試驗(yàn)陽性的菌株納入本研究，使用PCR方法檢測碳青霉烯酶基因

3、;體外藥敏試驗(yàn)檢測其對(duì)24種抗菌藥物的敏感性;多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法分析其克隆相關(guān)性。
　　2.對(duì)136株菌采用體外棋盤法評(píng)估磷霉素與亞胺培南、厄他培南、替加環(huán)素、多粘菌素E和阿米卡星的協(xié)同效果。進(jìn)行時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)明確磷霉素的殺菌方式以及磷霉素與其他5種抗菌藥物單用及聯(lián)合用藥的殺菌活性。最后通過時(shí)間-殺菌曲線篩選出殺菌效果較好的聯(lián)合方案，進(jìn)行不同給藥劑量的PASS-400血藥濃度自動(dòng)模擬實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算不同的藥效參數(shù)評(píng)估

4、給藥方案的抗菌效果。
　　3.將時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)與基因組研究相結(jié)合，從磷霉素的時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)中，于不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)取菌進(jìn)行全基因組測序，利用比較基因組學(xué)分析磷霉素在動(dòng)態(tài)給藥過程中藥物敏感性變化的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.170株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中，有136株產(chǎn)碳青霉烯酶表型確證試驗(yàn)陽性，且均攜帶blaKPC-2基因，其中有2株菌同時(shí)攜帶兩種碳青霉烯酶基因，一株攜帶blaKPC-2和blaIMP-4基因

5、，另一株攜帶blaKPC-2和blaIMP-8基因。這些菌株對(duì)所測抗菌藥物的藥敏結(jié)果顯示有83株為多重耐藥菌，53株為廣泛耐藥菌。MLST分型發(fā)現(xiàn)18種不同的ST型，6種新的型別提交pasteur數(shù)據(jù)庫。所有菌株中，有108株(79.4％)為ST11，9株(6.6％)為ST15，其余16種序列型流行率均低于1.5％，提示存在院內(nèi)克隆傳播現(xiàn)象。
　　2.棋盤法試驗(yàn)結(jié)果顯示磷霉素與其他5種藥物聯(lián)合以相加作用為主。其中與碳青霉烯類藥物聯(lián)

6、合的協(xié)同率較高，F(xiàn)M/IMP、FM/ETP的協(xié)同作用分別占15.44％和22.06％，其中，對(duì)磷霉素敏感的菌株，協(xié)同率有所增加（20.69％和34.48％）。時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)確定磷霉素對(duì)肺炎克雷伯菌的殺菌方式呈濃度依賴性。基于MIC和血藥濃度的時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)提示磷霉素1×MIC和替加環(huán)素（1 mg/L和1×MIC）單藥無明顯的殺菌作用;亞胺培南和厄他培南單藥1×MIC濃度在2小時(shí)可使細(xì)菌量下降1 log10 CFU/mL。多粘菌素

7、E單藥1×MIC在1h可引起3log10 CFU/mL細(xì)菌數(shù)量下降，然而4h后出現(xiàn)明顯的細(xì)菌再生。阿米卡星單藥1×MIC在12h時(shí)仍有明顯的殺菌作用。聯(lián)合給藥方案中，F(xiàn)M/COL和FM/AMK有明顯的協(xié)同作用，兩藥聯(lián)合后，明顯延長抗菌時(shí)間，增強(qiáng)殺菌作用，且隨著磷霉素濃度的增加，兩藥聯(lián)合的殺菌量也增大。進(jìn)一步PASS-400血藥濃度自動(dòng)模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FM/AMK和FM/COL的聯(lián)合給藥效果優(yōu)于單藥。對(duì)于敏感菌株，磷霉素（8g每8小時(shí)一次

8、）/阿米卡星（15 mg/kg每日一次）和磷霉素（8g每8小時(shí)一次）/多粘菌素E（2.5mg/kg每12小時(shí)一次）給藥方案的殺菌與恢復(fù)生長曲線與空白對(duì)照曲線的面積差(IE)比單藥高，分別為＞170和＞200 LogCFU/mL·h-1。
　　3.通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)磷霉素不同濃度不同給藥時(shí)間點(diǎn)的基因組差異率＜5％，耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)磷霉素單藥4×MIC濃度4小時(shí)和8×MIC濃度12小時(shí)較其他時(shí)間點(diǎn)和空白對(duì)照多注釋出一個(gè)抗菌藥物水解酶

9、。另外發(fā)現(xiàn)，磷霉素單藥32×MIC濃度6小時(shí)和12小時(shí)的兩個(gè)樣本中，在uhpT基因上游出現(xiàn)一個(gè)短片段uhpT基因的重復(fù)序列。
　　結(jié)論:
　　本研究通過對(duì)136株產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)和抗菌效果研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌存在院內(nèi)克隆傳播，具有多重耐藥特點(diǎn)。磷霉素對(duì)肺炎克雷伯菌呈濃度依賴性殺菌方式。UhpT轉(zhuǎn)運(yùn)體在導(dǎo)致磷霉素敏感性變化中起重要作用。磷霉素與亞胺培南、厄他培南、替加環(huán)素、多粘菌素E、阿米卡星聯(lián)