產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對磷霉素耐藥及傳播機制研究.pdf

1、KPC（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）型碳青霉烯酶首次于2001年被報道，主要分布于肺炎克雷伯菌中。近年來，產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌(KPC-KP)菌株在全球多國家地區(qū)廣泛流行，嚴重威脅人類健康。KPC-KP對幾乎所有β-內(nèi)酰胺類以及多種非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，使臨床抗菌藥物選擇十分受限。近年來，磷霉素因對多重耐藥菌株包括KPC-KP菌株仍有較好的抗菌活性而再度受到重視。我們前期研究發(fā)現(xiàn)浙醫(yī)一院

2、KPC-KP菌株磷霉素敏感率為43.4％，其中rmtB（質(zhì)粒攜帶氨基糖甙類耐藥基因，介導氨基糖甙類高水平耐藥）陽性菌株僅為8.5％，然而他們對磷霉素的耐藥機制尚不明確。本研究分為兩個部分：
　　第一部分對浙醫(yī)一院2010.1-2013.2間收集的97株KPC-KP菌株，通過瓊脂稀釋法測定其對磷霉素及其他抗菌藥物的MICs值，PCR和基因測序檢測耐藥基因攜帶情況，脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點序列分型(MLST)方法分析其克隆相

3、關性，并選取代表菌株行轉化接合試驗分析磷霉素滅活酶基因fosA3定位及其攜帶質(zhì)粒在菌株間傳播情況。最后fos基因陰性菌株通過PCR及測序檢測其磷霉素靶酶基因murA和轉運系統(tǒng)相關基因glpA、uhpT、uhpA、ptsI、cyaA是否存在突變;同時通過碳源生長實驗檢測轉運系統(tǒng)的功能。97株KPC-KP菌株中，共發(fā)現(xiàn)磷霉素耐藥菌株57株(58.74％)，其中44株為fosA3陽性，一株fosA陽性。其余12株不攜帶本研究中篩查的fos基因

4、。這些菌株對所測抗菌藥物包括碳青霉烯類、頭孢菌素類、氨基糖甙類、喹諾酮類和四環(huán)素類皆呈高比例耐藥，僅對多粘菌素E和替加環(huán)素表現(xiàn)出較高的敏感率，分別為100％和94.7％。57株磷霉素耐藥菌株中50株攜帶rmtB基因，可以解釋這些菌株對氨基糖甙類抗菌藥物的高水平耐藥。MLST共發(fā)現(xiàn)兩個序列型(STs)ST11和ST494，前者包含56株，后者僅包含一株fos基因陰性菌株。PFGE共發(fā)現(xiàn)5個脈沖類型(PTs)。44株fosA3陽性菌株皆屬于

5、ST11-PTA，說明浙醫(yī)一院fosA3陽性菌株為單克隆傳播。而fos陰性菌株基因背景相對復雜，包括ST11-PTA（6株）、ST11-PTB（4株）、ST11-PTC（1株）和ST494-PTD（1株）。fosA陽性菌株屬于ST11-PTE。12株fos基因陰性菌株，靶酶基因未發(fā)現(xiàn)突變，且皆可在G-6-P為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上生長，說明其磷酸己糖轉運系統(tǒng)(UhpT)功能正常。4株磷霉素耐藥菌株亦能在以G-3-P為唯一碳源的M9培養(yǎng)基

6、上生長，說明其甘油-3-磷酸轉運系統(tǒng)(GlpT)功能正常，其耐藥機制需進一步研究。8株不能在以G-3-P為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上生長，說明其GlpT系統(tǒng)存在功能異常，glpT基因分析發(fā)現(xiàn)其中3株存在glpT基因及氨基酸序列改變，包含2株發(fā)生DNA的△477A突變，一株發(fā)生氨基酸Cys309Phe突變。其余5株未發(fā)現(xiàn)uhpT基因序列改變，提示UhpT功能障礙可能與UhpT轉錄或表達水平下降有關。轉運系統(tǒng)相關調(diào)節(jié)基因uhpA和cyaA未發(fā)現(xiàn)

7、基因突變。而ptsI在12株磷霉素耐藥菌株中普遍存在氨基酸改變Ile569Asn，結合碳源生長實驗結果認為該突變?yōu)闊o義突變不影響ptsI編碼蛋白功能。代表菌株KP1034磷霉素抗性不能通過接合實驗傳遞到受體菌。其轉化菌KP1034-T含有一大小約136kb的質(zhì)粒，同時攜帶blaKPC-2、fosA3和rmtB基因，僅對替加環(huán)素、多粘菌素和喹諾酮類有足夠的敏感性。
　　第二部分從轉化菌KP1034-T中抽提質(zhì)粒pKP1034送上海邁

8、普科技有限公司進行全質(zhì)粒測序。然后對pKP1034全序列進行注解分析，并同相關質(zhì)粒比對，查看其質(zhì)粒骨架基因及多重耐藥區(qū)基因組成及結構特點，探討其演化過程。pKP1034為大小為136，848 bp的閉合環(huán)形DNA分子，平均GC含量為54.5％。經(jīng)過RAST注解共有191個閱讀編碼框，包含豐富的質(zhì)粒穩(wěn)定性相關基因和耐藥基因（blaKPC、rmtB、fosA3，blaSHV-12、blaCTX-M-65、blaTEM-1和catA2），然而

9、接合相關基因（tra基因）不完整，這與該質(zhì)粒不能通過接合實驗轉移到受體菌大腸埃希菌J53相一致。該質(zhì)粒為高度嵌合質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒不相容群分析屬于IncR-F33:A-:B-，可分為三個部分:攜帶catA2（氯霉素耐藥基因）的復合轉座子、traI和traB之間的片段（traI和traB皆為部分片段，被IS26截斷）和余下的基因結構。第二部分traI和traB之間的片段跟國內(nèi)流行fosA3陽性質(zhì)粒pHN7A8高度同源，第三部分同臺灣報道的肺炎克

10、雷伯菌來源的blaKPC陽性質(zhì)粒pKPC-LK30高度同源。通過對pKP1034、pHN7A8和pKPC-LK30分析比較，可推測pKP1034的演化過程:①pHN7A8中，攜帶catA2的復合轉座子插入到traI基因中，同時另一份IS26插入到traB中，該IS26同catA2下游的IS26方向相同;②catA2下游的IS26同新插入的IS26發(fā)生同源重組，導致兩份IS26中間的基因成分連同其中一份IS26從pHN7A8剪切下來，形成

11、一個環(huán)形分子;③被切除的環(huán)形分子中的IS26同pKPC-LK30中blaSHV-11下游的IS26再次發(fā)生同源重組，從而使該環(huán)形分子插入到pKPC-LK30中;④pKPC-LK30中resD基因下游插入一個拷貝IS1，其與vagD基因下游的IS1（不完整基因）方向相同，二者之間發(fā)生同源重組導致中間基因結構連同完整的IS1基因被剪切下來，最終形成與pKP1034高度同源的質(zhì)粒。其中，步驟③和④發(fā)生順序可以改變。pKP1034和相關質(zhì)粒多重

12、耐藥區(qū)（MRRs）深入比較分析發(fā)現(xiàn):①pKP1034中攜帶fosA3、blaCTX-M-65和blaTEM-1的MRR部分與pHN7A8的MRR基本相同，只是在pKP1034中，IS1294被新插入的IS26截斷，然后新插入的IS26與fosA3上游的IS26發(fā)生同源重組導致中間結構包括fosA3方向發(fā)生逆轉;②pKP1034中攜帶blaKPC和blaSHV-12的MRR部分與pKPC-LK30的MRR基本相同，但是pKPC-LK30攜

13、帶blaSHV-11而非blaSHV-12，前者為非超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，而后者為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，提示超廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaSHV-12可能由blaSHV-11發(fā)生突變演化而來。③pKP1034中blaKPC的基因環(huán)境來源于國內(nèi)流行的攜帶blaKPC基因的Tn3-Tn4401復合轉座子，只是在pKP1034中，Tn3部分可能因為IS26介導的同源重組而被部分切除掉。
　　本研究表明，浙醫(yī)一院KPC-KP菌株磷霉素耐藥率較高(5

14、8.74％)，其主要機制為攜帶（44株）滅活酶基因fosA3，另有一株攜帶fosA。這些菌株對所測抗菌藥物皆高比例耐藥，僅對多粘菌素E和替加環(huán)素表現(xiàn)出足夠高的敏感率，分別為100％和94.7％。fosA3陽性KPC-KP菌株為單克隆傳播，皆屬于ST11-PTA型。代表菌株fosA3陽性質(zhì)粒pKP1034為一高度嵌合的多重耐藥質(zhì)粒，由KPC陽性質(zhì)粒pKPC-LK30和國內(nèi)攜帶fosA3的流行質(zhì)粒pHN7A8經(jīng)經(jīng)過IS26和IS1介導的多次