耶爾森氏菌91001株基因組測(cè)序、比較基因組學(xué)及Ⅲ型分泌系統(tǒng)研究.pdf

1、鼠疫耶爾森氏菌是烈性傳染病鼠疫的病原體，曾在世界上引起過(guò)三次大流行，造成至少一億六千萬(wàn)人的死亡。近年，隨著鼠疫作為生物恐怖戰(zhàn)劑的活動(dòng)有所增加，鼠疫病例的上升，多重耐藥菌的出現(xiàn)及致病機(jī)制仍不十分明確，因此，進(jìn)行鼠疫的致病研究非常重要。為了進(jìn)一步探索鼠疫致病的分子機(jī)制，我們進(jìn)行鼠疫耶爾森氏菌91001株基因組測(cè)序、強(qiáng)致病性與弱致病性株間的比較基因組學(xué)分析，比較已知毒力島及毒力基因的變化，鑒定可能的新毒力因子，并進(jìn)一步分析了鼠疫耶爾森氏菌等革

2、蘭氏陰性菌中廣泛存在的毒力島——Ⅲ型分泌系統(tǒng)的序列及結(jié)構(gòu)特征，深入探索了基于模體保守和結(jié)構(gòu)保守的可能的分子伴侶分泌信號(hào)機(jī)制。 鼠疫耶爾森氏菌91001株的全基因組序列測(cè)定及注釋通過(guò)鳥(niǎo)槍法測(cè)定對(duì)人無(wú)致病性，而對(duì)小白鼠表現(xiàn)強(qiáng)毒的91001株全基因組序列，并與完成測(cè)序的對(duì)人具有強(qiáng)致病性的C092株和KIM株進(jìn)行對(duì)比研究，從基因組水平了解鼠疫耶爾森氏菌對(duì)人致病機(jī)制的序列基礎(chǔ)，尋找新的毒力基因，進(jìn)一步揭開(kāi)鼠疫對(duì)人體致病的分子基礎(chǔ)。通過(guò)鳥(niǎo)槍

3、法測(cè)序獲得一條染色體序列及四個(gè)質(zhì)粒pPCP1、pMT1、pCD1和pCRY序列，分別長(zhǎng)約4，595，065bp，9，609bp，106，642bp，70，159bp，21，742bp，其中質(zhì)粒pMT1、pCD1和pPCP1的序列與參考株C092和KIM株基本一致，質(zhì)粒pCRY為新發(fā)現(xiàn)的、未見(jiàn)報(bào)道的質(zhì)粒，具有獨(dú)立復(fù)制能力，編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)基因。染色體基因組上共編碼4，037個(gè)CDS，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有關(guān)基因100個(gè)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分泌基因20

4、4個(gè)，DNA復(fù)制、重組和修復(fù)基因296個(gè)，轉(zhuǎn)錄、調(diào)控基因205個(gè)，假基因141個(gè)。pCD1質(zhì)粒上共預(yù)測(cè)基因98個(gè)，主要編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因簇，pMT1質(zhì)粒上共預(yù)測(cè)基因129個(gè)，大部分是假定蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了1193個(gè)蛋白，占基因組預(yù)測(cè)CDS的28.7％，完全對(duì)應(yīng)于染色體上的預(yù)測(cè)基因。 鼠疫耶爾森氏菌比較基因組學(xué)研究通過(guò)生物信息學(xué)方法比較鼠疫耶爾森氏菌C092、KIM和91001株的基因組發(fā)現(xiàn)，三株菌染色體上均存在著

5、較多的IS序列，由它所介導(dǎo)的同源重組導(dǎo)致三株菌染色體的整體基因組結(jié)構(gòu)變化較大。C092和KIM株含有91001沒(méi)有的獨(dú)立DNA片斷。從編碼基因上看，強(qiáng)毒株C092和kIM染色體上編碼而在弱毒株91001中缺失的基因共93個(gè)(不含假基因)，其中毒力蛋白4個(gè)，調(diào)控蛋白6個(gè)，酶與代謝有關(guān)的蛋白20個(gè)，噬菌體有關(guān)的蛋白29個(gè)，鞭毛蛋白3個(gè)，膜蛋白8個(gè)，脂蛋白1個(gè)，假定蛋白21個(gè)，其中保守假定蛋白8個(gè)。已知毒力基因及毒力島(Ⅲ型、Ⅳ型分泌系統(tǒng))基

6、因編碼完整，沒(méi)有缺失或成為假基因。通過(guò)序列比對(duì)、模體搜索等方法對(duì)C092及KIM株共有而91001株缺失的基因進(jìn)行分析，鑒定了7個(gè)可能的新毒力基因和3個(gè)與耐藥性有關(guān)的基因，另外，膜蛋白YP01483也可能參與細(xì)菌對(duì)人的致病過(guò)程。 Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶序列并不相似但存在特征保守模體Ⅲ型分泌系統(tǒng)是鼠疫耶爾森氏菌的重要毒力島之一，它廣泛存在于革蘭氏陰性致病菌中，專一性地將毒力因子直接注射到宿主細(xì)胞質(zhì)中，其中某些效應(yīng)蛋白(即毒力相關(guān)蛋白

7、)需要特定的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶才能有效分泌。以往的研究發(fā)現(xiàn)：這些分子伴侶之間的序列甚至分子伴侶和底物結(jié)合區(qū)的序列都不相同，但是2000年cheng等依據(jù)裝置蛋白的高度保守性提出：不同的分子伴侶中應(yīng)該存在保守的氨基酸序列或保守的分泌信號(hào)的假說(shuō)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析了35個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)該蛋白特征性的保守模體，并基于該模體提出了Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶的功能分類。盡管這些分子伴侶間序列并不同源，但同一模體家族中

8、含有一些保守的位點(diǎn)，這些保守的位點(diǎn)可能對(duì)于維護(hù)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到重要作用?；谔卣髂ｓw和序列同源分析，我們預(yù)測(cè)出70個(gè)新的可能的分子伴侶，并結(jié)合Birtalan的研究提出了一個(gè)新的假說(shuō)：同一功能家族的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶，而不是全部的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶，可能形成一個(gè)相同的空間結(jié)構(gòu)。 同一功能家族的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶可能具有保守的結(jié)構(gòu)以前的研究表明，Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶SicP、CesT、SigE、SycE這四個(gè)蛋白具有相似的

9、空間結(jié)構(gòu)，Spa15雖然包含相同的折疊類型，但是形成不同的二聚體。我們使用Dali軟件進(jìn)行另外3個(gè)已知結(jié)構(gòu)分子伴侶SycN、SycH、AvrPphF與CesT間的兩兩結(jié)構(gòu)比較，結(jié)果顯示這三個(gè)分子伴侶均與CesT具有明顯相似的結(jié)構(gòu)。通過(guò)BLAST進(jìn)行分子伴侶與PDB庫(kù)的序列比對(duì)，結(jié)果顯示未知結(jié)構(gòu)的分子伴侶與PDB庫(kù)中的序列無(wú)同源序列，采用threading算法預(yù)測(cè)未知晶體結(jié)構(gòu)的分子伴侶的折疊類型，結(jié)果表明2nd模體和7th模體家族具有類似

10、的折疊類型，3rd模體家族含有相同的折疊類型，1st模體家族含有相同的折疊類型，還有4個(gè)未找到明顯特征模體的分子伴侶含有不同的折疊類型。該結(jié)果支持了我們提出的假說(shuō)：同一家族的分子伴侶，而非所有的分子伴侶，形成相同的空間結(jié)構(gòu)。 基于結(jié)構(gòu)保守的分子伴侶分泌機(jī)制的探索Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌信號(hào)存在三種假說(shuō)：N末端假說(shuō)、分子伴侶假說(shuō)及mRNA假說(shuō)?，F(xiàn)在趨向于認(rèn)為，所有的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶形成一個(gè)相同的空間結(jié)構(gòu)和功能類型，這個(gè)相同的空間結(jié)構(gòu)