Lactobacillus helveticus H9全基因組測序及蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、Lactobacillus helveticus H9(LABCC IMAU60208)和Lactobacillus helveticus H10（LABCC IMAU60227）是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室從中國西藏采集樣品中分離鑒定得到，于乳品生物技術與工程教育部重點實驗室菌種庫保藏。經(jīng)篩選及實驗驗證Lactobacillus helveticus H9是一株蛋白水解活性較強，可發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生具有潛在降血壓活

2、性肽類物質(zhì)的菌株；Lactobacillus helveticus H10也是一株蛋白水解活性較強，但是在發(fā)酵乳的過程中不產(chǎn)生具有降血壓活性的肽類物質(zhì)。
　　為了探尋了解Lactobacillus helveticus H9發(fā)酵乳可以產(chǎn)生具有ACE抑制活性的物質(zhì)的途徑和機理，本研究采用全基因組測序和蛋白質(zhì)組學研究相結(jié)合的方法進行研究分析。
　　采用Roche454和Illumina Solexa兩種高通量測序技術測定了菌株H

3、9和對照菌株H10的全基因組序列，并且進行了比較基因組學研究，重點分析了乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)的相關信息?；蚪M測序結(jié)果表明Lactobacillus helveticus H9和Lactobacillus helveticus H10染色體基因組均為閉合環(huán)狀分子，染色體長度分別為1,871,119bp和2,145,899bp，通過序列預測分析分別得到1815和2049個開放閱讀框。通過 COG功能分類和KEGG數(shù)據(jù)庫對Lactobacil

4、lus helveticus H9糖代謝、氨基酸代謝、蛋白水解系統(tǒng)、核酸代謝進行了分析，同時分析了菌株產(chǎn)胞外多糖的能力、CRISPR基因簇、插入序列等。利用比較基因組學研究對菌株H9、H10和DPC4571的蛋白水解系統(tǒng)進行了詳盡的分析，通過分析表明細胞壁蛋白水解酶PrtH、胞內(nèi)肽酶PepN、PepO和PepX是菌株產(chǎn)ACE抑制肽的關鍵酶。
　　采用蛋白質(zhì)組學研究技術和方法，構(gòu)建了Lactobacillus helveticus

5、H9在乳中發(fā)酵不同生長時期的蛋白質(zhì)組參考圖譜，分析菌株在不同生長時期的蛋白質(zhì)表達情況，重點對在后兩個時期表達的乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)的相關蛋白進行了分析。通過二維凝膠電泳圖譜得到菌株在三個生長時期的蛋白斑點數(shù)，分別為729（發(fā)酵初期）、1020（對數(shù)生長期）和925個（穩(wěn)定期）。利用質(zhì)譜鑒定其中差異蛋白點275個，其中233個鑒定成功，對鑒定成功的蛋白點進行了COG功能分類，主要是與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成相關蛋白；核酸轉(zhuǎn)運及代謝相關蛋白；碳

6、水化合物轉(zhuǎn)運及代謝相關蛋白；氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝相關蛋白等。其中與蛋白水解系統(tǒng)相關的蛋白PepN、PepE、PepO2以及OppC是在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期都表達的蛋白，這與發(fā)酵試驗中在這兩個時期可以檢測到ACE抑制活性的結(jié)果相一致，所以我們初步推測Opp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是菌株在乳中生長利用乳蛋白所必須的，PepN、PepO2以及PepE可能與菌株在發(fā)酵乳的過程中產(chǎn)ACE抑制肽具有相關性。
　　采用實時熒光定量PCR技術全面分析了Lactobac

7、illus helveticus H9在乳中生長的三個階段蛋白水解系統(tǒng)相關酶基因的表達變化情況，同時還對蛋白質(zhì)組學研究中出現(xiàn)的部分蛋白點進行了基因表達驗證。
　　該研究項目的實施和完成，使我們?nèi)嬲J識了Lactobacillus helveticus H9的全基因組信息，有助于我們對該菌株及瑞士乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)進一步的了解，同時掌握了該菌株在乳中發(fā)酵生長過程中蛋白質(zhì)的組成以及表達規(guī)律，進而為探索乳酸菌產(chǎn)生ACE抑制肽的機制提供