家蠶蛋白質(zhì)組表達(dá)譜分析及基因組注釋.pdf

1、在家蠶基因組草圖和精細(xì)圖完成之后，家蠶的研究就進(jìn)入了后基因組時(shí)代。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是功能基因組學(xué)研究的核心內(nèi)容，也是后基因組時(shí)代的研究重點(diǎn).雙向電泳技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的三大支柱，近些年來，隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和儀器以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展和更新，使蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)入了一個(gè)大規(guī)模，高通量的時(shí)代，極大的提高了蛋白質(zhì)組表達(dá)譜鑒定的效率和可靠性。本文主要利用鳥槍蛋白質(zhì)組測(cè)序方法，分析了家蠶后部絲腺、中部絲腺、腦、咽下神經(jīng)

2、節(jié)、前胸腺、胚胎、頭、血液等不同組織、器官，以及野蠶不同時(shí)期后部絲腺的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，同時(shí)，對(duì)家蠶后部絲腺進(jìn)行了系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的分析，以揭示后部絲腺發(fā)育和絲蛋白合成的機(jī)理。另外，利用獲得的大量質(zhì)譜數(shù)據(jù)，運(yùn)用蛋白質(zhì)基因組學(xué)和比較基因組學(xué)的研究方法，對(duì)家蠶基因組的注釋進(jìn)行了完善，主要獲得了以下研究成果：
　　 1.運(yùn)用基因芯片技術(shù)，用22987探針，分析了p50家蠶四眠、五齡第1、3、5、7(熟蠶)天后部絲腺

3、的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，研究發(fā)現(xiàn)在四眠期和熟蠶期有大量的特異表達(dá)基因，其中很多都與特定的生理狀態(tài)密切相關(guān)，比如有大量的表皮蛋白的基因在四眠期特異表達(dá).相比之下，在食桑期特異表達(dá)的基因卻極少，這說明在五齡期大部分基因是隨著絲腺細(xì)胞的快速生長(zhǎng)而同步擴(kuò)增的，其表達(dá)量并沒有出現(xiàn)明顯的波動(dòng)。絲素重鏈、輕鏈，P25，seroin1，seroin2這5個(gè)絲基因在五齡第3天基本上都出現(xiàn)了比較明顯的上調(diào)，并延續(xù)至五齡第5天，到熟蠶期變得比較平緩，這與絲素合成分泌

4、的效率變化是一致的。與翻譯相關(guān)的基因包括核糖體蛋白和翻譯起始因子的表達(dá)從四眠期到五齡第5天都保持基本穩(wěn)定，而到了熟蠶期出現(xiàn)明顯的波動(dòng)，大部分基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，這可能是導(dǎo)致絲素合成減少甚至絲腺分解的一個(gè)重要因素。對(duì)643個(gè)出現(xiàn)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)了43個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)譜與絲素合成和絲腺生長(zhǎng)速率的變化趨勢(shì)一致，其中包括seroin1，糖運(yùn)輸?shù)鞍椎龋凳玖诉@些基因可能與絲腺的這些生物過程有密切關(guān)系，而PathwaySt

5、udio軟件分析發(fā)現(xiàn)在不同聚類群內(nèi)的基因可能存在共調(diào)控或直接相互作用的關(guān)系以及復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。多個(gè)激素相關(guān)基因也出現(xiàn)了不同的表達(dá)譜，表明激素也可能是參與絲素合成和絲腺發(fā)育的重要調(diào)控因素。另外，我們用雙向電泳技術(shù)以及Pro-Q Diamond磷酸化熒光染料染色和銀染分別檢測(cè)了這5個(gè)時(shí)期后部絲腺的磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了222個(gè)差異表達(dá)蛋白，而磷酸化蛋白斑點(diǎn)數(shù)不及總蛋白斑點(diǎn)數(shù)的1/5，這遠(yuǎn)低于其他真核生物細(xì)胞30％的磷酸化

6、水平，我們推測(cè)這可能與后部絲腺細(xì)胞在胚后發(fā)育過程中并不發(fā)生細(xì)胞分裂、分化，因而減少了蛋白磷酸化在這方面的調(diào)控功能有關(guān)。但是還有些蛋白在不同生理狀態(tài)下出現(xiàn)磷酸化水平和狀態(tài)的變化，表明這些蛋白磷酸化的變化和生理變化有密切的關(guān)系。這些蛋白包括核糖體蛋白P2，肌動(dòng)蛋白解聚因子1，烯醇酶等，它們可能與家蠶蛻皮和絲素的合成分泌等有關(guān)系。我們還用鳥槍蛋白質(zhì)組測(cè)序方法和無標(biāo)定量分析了五齡第3、5天以及熟蠶期后部絲腺的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，分別鑒定了1366

7、，1466，和1280個(gè)蛋白，其中825是共同表達(dá)的，而分別有306，205，和126個(gè)屬于時(shí)期特異表達(dá)蛋白。其中熟蠶特異的蛋白中發(fā)現(xiàn)了許多小分子熱激蛋白，這與雙向電泳的結(jié)果一致，這表明小分子熱激蛋白和熟蠶期的生理狀態(tài)密切相關(guān)，另外，還有蛻皮激素受體等，定量分析表明許多與泛素-蛋白酶體通路相關(guān)蛋白在熟蠶期出現(xiàn)顯著的上調(diào)，說明該通路在即將到來的絲腺程序性細(xì)胞死亡過程中可能發(fā)揮重要的作用.在五齡第5天出現(xiàn)顯著上調(diào)最多的是與核糖體通路相關(guān)的蛋

8、白，下調(diào)最多的是與蛋白酶體通路相關(guān)的蛋白，由于基因芯片分析結(jié)果表明核糖體蛋白的基因表達(dá)在絲素高效合成時(shí)期的表達(dá)是平穩(wěn)的，因此我們推測(cè)核糖體蛋白的基因在翻譯水平上的調(diào)控會(huì)對(duì)絲素合成和絲腺發(fā)育有重要影響。而在熟蠶期的表達(dá)情況與五齡第5天剛好相反，更多的涉及蛋白酶體通路的蛋白出現(xiàn)顯著上調(diào)，而與核糖體通路相關(guān)的蛋白出現(xiàn)明顯的下調(diào)，綜合上面的結(jié)果，說明家蠶絲腺的細(xì)胞程序性死亡過程有可能在五齡末期就已經(jīng)開始了。
　　 我們還對(duì)家蠶五齡第3天

9、的中部絲腺前、中、后三個(gè)區(qū)段進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組分析，分別鑒定了651、601和831種蛋白，區(qū)段特異的蛋白分別為53、14和171個(gè)，而在共同表達(dá)的蛋白中，出現(xiàn)顯著差異表達(dá)的蛋白很少，這說明中部絲腺的后段是合成絲膠蛋白的關(guān)鍵部位，而特異表達(dá)的蛋白則可能與表達(dá)的絲膠蛋白的種類不同有關(guān).與五齡第三天的后部絲腺的蛋白質(zhì)組相比，有大量的蛋白出現(xiàn)了顯著的差異表達(dá)，這可能與中部絲腺和后部絲腺的功能差異有關(guān)。
　　 對(duì)野蠶后部絲腺五齡第3、5天

10、的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜定量分析表明，在第5天顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)主要是核糖體蛋白，這與家蠶的分析結(jié)果一致。而家蠶后部絲腺五齡第3、5天都比相應(yīng)時(shí)期野蠶中都高表達(dá)的16種蛋白中，有10種是核糖體蛋白。這些結(jié)果都表明核糖體蛋白的顯著上調(diào)與絲蛋白的大量合成有密切的關(guān)系。
　　 2.家蠶內(nèi)分泌系統(tǒng)腦，咽下神經(jīng)節(jié)、前胸腺的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜分析鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已知的組織特異蛋白都可以通過我們的結(jié)果得到驗(yàn)證，比如促前胸腺激素，黑化激素前激素原，RXR型激

11、素受體包括USP同源物等都可在腦中得到特異鑒定，而滯育激素和信息素生物合成活化神經(jīng)肽則是在咽下神經(jīng)節(jié)中得到特異鑒定，在前胸腺中我們特異地鑒定到兩種與蛻皮激素合成有關(guān)的蛋白Cyp302a1和Rieske-domain protein Neverland，這說明了我們這種方法的可靠性.而共同表達(dá)的蛋白中，有許多功能重要的蛋白都是第一次在這些內(nèi)分泌器官中發(fā)現(xiàn)，而這些蛋白可能使這三個(gè)器官超越傳統(tǒng)的已知的生物功能，表明盡管三個(gè)器官有各種特異的功能

12、，而該特異功能也是在其他器官的密切配合下完成的。
　　 3.我們用鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了家蠶戊2期和已3期的胚胎蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，在戊2期胚胎中，我們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶，山梨醇脫氫酶，蛻皮激素磷酸鹽磷酸酶，MEK激酶，MAPK-ERK(MEK)激酶等與胚胎滯育解除有著直接關(guān)系的蛋白，而這些蛋白在滯育解除后4天的胚胎中依然存在，表明它們可能還負(fù)責(zé)維持胚胎的正常發(fā)育。我們還檢測(cè)到許多與激素代謝，神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、表皮發(fā)育，應(yīng)激反

13、應(yīng)，免疫，生殖相關(guān)的蛋白。而在已3期胚胎中，最典型的是出現(xiàn)了大量的肌肉組織相關(guān)蛋白，以及一些重要的化學(xué)感應(yīng)蛋白等。這表明胚胎發(fā)育過程中，器官形成先后是由基因的程序性表達(dá)控制的。Real-Time qRT-PCR分析表明基因的表達(dá)水平和蛋白的含量并不是完全一致，說明在胚胎的基因表達(dá)存在廣泛的翻譯水平上的調(diào)控。
　　 4.經(jīng)家蠶頭部鳥槍蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)了大量的肌肉組織蛋白，且其表達(dá)量很高，與頭部蛋白質(zhì)雙向電泳的結(jié)果吻合。另外還有豐

14、富的化學(xué)感應(yīng)蛋白，這與頭上廣泛分布的感覺器官以及神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。通路分析結(jié)果表明，很多鑒定獲得的蛋白與阿爾茨海默氏病、三羧酸循環(huán)、帕金森氏病通路的蛋白同源。其中導(dǎo)致這兩種神經(jīng)退化疾病的關(guān)鍵基因APP，PSEN和SNCA，它們的同源物都在我們的研究中鑒定得到，考慮到果蠅已經(jīng)被證明是一個(gè)非常有效的分析這類疾病過程中基因功能的模型，以及家蠶中有很多基因與參與人類神經(jīng)退化失調(diào)疾病的基因同源，家蠶也有可能被作為一個(gè)新的研究人類疾病的模型。