家蠶30K蛋白基因組分析及蛋白質(zhì)鑒定.pdf

1、家蠶30K蛋白是由其脂肪體合成的非雌特異性脂蛋白。它們是家蠶生長發(fā)育過程中主要儲藏蛋白之一。對雌性家蠶，30K蛋白還是卵黃原蛋白的重要組成部分。目前，除了煙青蟲的微卵黃蛋白原與該類蛋白比較相似外，其它的鱗翅目昆蟲還未見報道。30K蛋白在家蠶體內(nèi)表達(dá)量非常的高，它在家蠶卵黃原蛋白中的比例甚至可以占35﹪左右。由于其表達(dá)量很高，并且具有很多的種類，它對家蠶可能起著非常重要的生理作用，但具體功能研究的報道較少。家蠶基因組完成以后，為了探索30

2、K蛋白的生理功能，我們在全基因組水平上分析了30K蛋白基因家族的構(gòu)成情況，并利用基因組數(shù)據(jù)和雙向電泳等方法對該類蛋白做了進(jìn)一步的探索。 對家蠶全基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)家蠶共有10個30K蛋白基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)氮基酸數(shù)目在246～271個之間，理論等電點(diǎn)在6.1～8.4之間，分子量在28～31kD之間，它們的氨基酸序列同源性在60﹪以上。目前報道的30K蛋白基因組序列只有3條，由于發(fā)現(xiàn)了新的基因，故我們對10個基因

3、重新命名；由于該類蛋白是屬于低分子量脂蛋白(LP)家族，所以根據(jù)它們與報道的30K蛋白的相似度由高到低命名為Bmlp1～Bmlp10。 分析EST數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)每個基因所比對上的EST序列條數(shù)差異很大，Bmlp1、Bmlp2、Bmlp3、Bmlp7、Bmlp9的EST數(shù)目都在200條以上，其他基因的EST數(shù)目比較少，而Bmlp10的EST只有一條，Bmlp5沒有EST。這表明它們的表達(dá)量可能存在差異。 對這些基因編碼的氨基酸

4、序列分析發(fā)現(xiàn)，它們的編碼序列都位于一個外顯子上，并且每一個編碼氨基酸序列都含有一個信號肽序列。除Bmlp1、Bmlp8和Bmlp9三個基因之外，其他7個基因都含有30kP蛋白酶A的降解位點(diǎn)。這些不同的位點(diǎn)可能導(dǎo)致它們具有不同的降解產(chǎn)物和功能。聚類分析發(fā)現(xiàn)，所有的30K蛋自可以分成3類，這可能與它們的進(jìn)化有非常緊密的關(guān)系。對其基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示這些甚因的上游調(diào)控序列都有一個啟動子，這些啟動子呈現(xiàn)典型TATA結(jié)構(gòu)特征。對其潛在的調(diào)控元

5、件分析發(fā)現(xiàn)，每一個基因都含有一個以上的SP1和GATA-1基序，Bmlp1、Bmlp4、Bmlp7、Bmlp8和Bmlp10都含有NF-κB基序，而Bmlp2、Bmlp4、Bmlp5、Bmlp8和Bmlp10都含有Oct-1基序。這些調(diào)控元件可能調(diào)控相應(yīng)30K蛋白基因的特異性表達(dá)。對Bmlp5的分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動子部分插入了一個轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶基因。 通過RT-PCR檢測10個30K蛋白基因在脂肪體的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，除Bmlp5和B

6、mlp10沒有表達(dá)，其余8個基因都有表達(dá)。這8個基因的表達(dá)起始和持續(xù)時間都不同。根據(jù)聚類分析，這8個基因分化為4個組，而分析它們的上游調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)這4個組中含有NF-kB調(diào)控元件的基因開始表達(dá)的時間要比沒有該因子的基因要晚，推測可能該元件具有延遲基因表達(dá)時間的功能。而對兩個沒有檢測到表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Bmlp5和Bmlp10基因與Bmlp6基因都同樣位于同一條scaffold上，同時Bmlp5的啟動子部分插入的轉(zhuǎn)座酶基因可能是

7、導(dǎo)致該基因不表達(dá)的主要原因。這些基因非常的相似，可能來源于共同的祖先。分析它們的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些基因在早期分化成3類，其中兩類的基因在后來的進(jìn)化中演化出更多的種類，這可能與它們的功能分化密不可分。 對不同家蠶品種的血液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和銀染后，分析30K蛋白圖譜發(fā)現(xiàn)，除C108品種具有5條蛋白質(zhì)條帶之外，其余調(diào)查品種都主要表現(xiàn)出4條蛋白條帶。每一種30K蛋白在不同品種之間表達(dá)起始時期不完全一樣，并且表達(dá)周期也不一樣長，

8、這可能與品種的差異具有很大的關(guān)系。 將血液蛋白進(jìn)行雙向電泳分析發(fā)現(xiàn)，30K蛋白部分能得到比較清晰的蛋白圖譜，5齡6天和化蛹3天的蛋白點(diǎn)具有一定差異。選擇電泳圖譜比較清晰的化蛹3天的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記，并用質(zhì)譜鑒定。 利用家蠶基因組數(shù)據(jù)，并用GPMAW軟件建立編碼氨基酸的胰蛋白酶酶解數(shù)據(jù)庫，通過檢索發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)記的點(diǎn)中，有14個蛋白點(diǎn)是家蠶30K蛋白。這些蛋白點(diǎn)的肽段匹配都在4個以上，它們的覆蓋率都在20﹪以上，但是有的蛋白點(diǎn)的

9、質(zhì)量指紋圖譜可以匹配上兩個蛋白，并且具有的相同多肽段也不超過3個，兩個匹配的蛋白之間不相同的多肽在4個以上，因此很可能一個蛋白點(diǎn)內(nèi)包含有兩個蛋白。14個匹配的30K蛋白點(diǎn)能匹配上的基因?yàn)?個，還有3個在mRNA水平有表達(dá)的基因沒有檢測到。對這5個基因而言，有的對應(yīng)了幾個蛋白點(diǎn)，這可能是由于蛋白質(zhì)修飾而產(chǎn)生等電點(diǎn)的變化形成的。其中有3個基因沒有檢測到，可能是由于表達(dá)量比較低或者質(zhì)譜檢測的時候信號太弱而被屏蔽。綜上所述，家蠶30K蛋白不僅成

10、員多，每一個蛋白之間的相似性也很高，編碼它們的基因也可能具有共同的起源。30K蛋白基因之間，主要的變化包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)域和調(diào)控區(qū)域，前者導(dǎo)致如蛋白酶水解位點(diǎn)的不同，后者可能導(dǎo)致各個基因具有獨(dú)特的表達(dá)模式。因此，家蠶30K蛋白基因在進(jìn)化過程中伴隨了功能的分化。我們相信，其高表達(dá)量、多成員、和已經(jīng)報道的脂蛋白運(yùn)輸、抑制細(xì)胞凋亡等，是其證據(jù)的一部分。30K蛋白對之于家蠶，是值得進(jìn)一步深入探討的重要蛋白質(zhì)。通過對該群基因的研究，特別是對各種30