家蠶30K蛋白基因的克隆表達及其抗凋亡功能研究.pdf

1、家蠶30K載脂蛋白是家蠶幼蟲血淋巴中主要的一群低密度脂蛋白，除載脂功能，還具有較強的抑制昆蟲和哺乳動物細胞凋亡的活性。體內高血脂和自由基的堆積均可導致血管內皮細胞的凋亡，從而引起其功能發(fā)生異常。血管內皮細胞凋亡在動脈粥樣硬化形成過程中具有至關重要的作用。由于家蠶30K蛋白兼具載脂功能和抗細胞凋亡的活性，推測其可能具有抑制人血管內皮細胞的凋亡從而保護血管內皮細胞的功能。因此，研究家蠶30K蛋白在血管內皮細胞凋亡過程中的作用極可能具有重要意

2、義，進而可通過探索其藥用價值，為防治和治療動脈粥樣硬化疾病提供新途徑、新基礎。
　　 家蠶30K蛋白基因在進化過程中產生很多種基因，編碼的蛋白均具有相似的結構。本研究在前人研究的基礎上，利用生物信息學工具，根據已報道的具有抗細胞凋亡功能的家蠶30K蛋白基因BmLp-c6（GenBank登錄號:X54735）編碼的氨基酸序列，與NCBI數據庫進行同源性比對分析，獲得兩個與BmLp-c6同源性較高的家蠶30K蛋白其基因序列分別為Bm

3、Lip-19G1(GenBank登錄號:AY568957)和BmLp-C12p(GenBank登錄號:NM_001101728)。然后利用RT-PCR技術從家蠶蛹中克隆了上述三條家蠶30K蛋白基因，并在家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統中進行大量融合表達、純化。表達產物純化后經SDS-PAGE可檢測到純度較高的、分子量大小約為30kD的目的蛋白條帶。Western blotting分析結果顯示3種目的蛋白與融合表達標簽6×His-

4、tag單克隆抗體具有良好的特異性反應。
　　 利用自建的H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的體外損傷及凋亡模型，研究家蠶30K蛋白對H2O2誘導的HUVEC凋亡的保護作用。MTT法檢測結果顯示:3種30K蛋白均可一定程度上增強HUVEC細胞的活力。對胞內8-異前列腺素F2a（8-Isoprostane）（氧化應激標志物）濃度檢測結果顯示:利用H2O2處理HUVEC，可明顯增加胞內8-isoprostane的濃度，而3種3

5、0K蛋白均可顯著降低胞內8-isoprostane的濃度，表明3種30K蛋白均可通過降低細胞內的氧化應激程度從而保護HUVEC。DNA片段化ELISA檢測結果顯示:3種30K蛋白均可降低HUVEC胞內DNA片段化程度，表明3種30K蛋白對H2O2誘導的HUVEC細胞的凋亡均具有一定的抑制作用。流式細胞儀細胞凋亡檢測結果也顯示:3種30K蛋白均具有不同程度的降低HUVEC凋亡率的作用。綜上所述，3種家蠶30K蛋白均可通過抑制H2O2誘導的