家蠶BmDichaete基因的克隆及功能初探.pdf

1、Sox基因家族是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族。自從1990年Sinclair等在人類(lèi)和小鼠中克隆了哺乳動(dòng)物性別決定基因——睪丸決定因子SRY/Sry(sex-determiningregionofY)基因后,一系列與之同源、編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因相繼被發(fā)現(xiàn),統(tǒng)稱(chēng)為Sox基因家族。Sox基因家族是存在于動(dòng)物個(gè)體中的與動(dòng)物性別決定因子SRY具有高度序列相似性的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族,其特征是含有一個(gè)高度保守的與DNA結(jié)合相關(guān)的高遷移率盒(highmobil

2、itybox,HMG-box)結(jié)構(gòu)域。Sox基因家族廣泛參與了生物多種發(fā)育過(guò)程,在動(dòng)物性別決定與分化、生殖腺發(fā)育、早期胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨發(fā)生及血管發(fā)生等多種組織器官的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)的典型代表,是一類(lèi)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),也是良好的模式生物,但家蠶Sox基因的研究還處于起步階段。Dichaete基因?qū)儆赟ox基因家族B亞族基因,首先在黑腹果蠅中被發(fā)現(xiàn),與哺乳動(dòng)物中的Sox2同源性最高

3、,自發(fā)現(xiàn)以來(lái)即受到廣泛的關(guān)注。該基因也是作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與個(gè)體發(fā)育特別是個(gè)體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,它還參與了個(gè)體后腸發(fā)育、卵母細(xì)胞形成等多種發(fā)育過(guò)程。
　　 本文基于其他模式生物的先進(jìn)研究成果及家蠶基因組信息,分析并克隆了果蠅Dichaete基因的家蠶同源基因BmDichaete基因,并對(duì)其表達(dá)及功能進(jìn)行了研究,得到了如下研究結(jié)果。
　　 1,家蠶BmDichaete基因的克隆及序列分析
　　 利用家蠶EST數(shù)據(jù)

4、電子克隆了果蠅DmDichaete基因在家蠶中的同源體,定位于第四號(hào)染色體nscarf2589上,命名為BmDichaete。通過(guò)Race技術(shù)成功克隆了家蠶BmDichaete基因完整的cDNA序列,全長(zhǎng)為1541bp,其ORF長(zhǎng)741bp(ORF:112-852),編碼246個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小為27.3kDa,等電點(diǎn)為9.89。通過(guò)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),編碼蛋白的第39個(gè)氨基酸到第107個(gè)氨基酸之間,有一個(gè)Sox基因家族的保守結(jié)構(gòu)域

5、HMG-box?；蚪M序列分析結(jié)果顯示BmDichaete基因完整的ORF即為一個(gè)外顯子,不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu),這也同Sox基因家族B亞族基因的特點(diǎn)相吻合。同源性分析結(jié)果表明,BmDichaete基因在進(jìn)化上高度保守,與其脊椎動(dòng)物及非脊椎動(dòng)物中的同源基因在HMG-box結(jié)構(gòu)域內(nèi)高度保守(≥90%),在HMG-box區(qū)外也有一定的序列相似性;家蠶中Sox基因成員之間在HMG-box區(qū)保守性約為50%,HMG-box區(qū)外基本無(wú)序列相似性。

6、>　　 2,家蠶BmDichaete基因的原核表達(dá)
　　 由于BmDichaete基因與亞族內(nèi)的其它基因相比,它們?cè)贖MG-box區(qū)的序列相似性達(dá)到了90%以上,為了研究方便,實(shí)驗(yàn)中我們表達(dá)了兩段BmDichaete基因的片段。根據(jù)BmDichaete基因的完整cDNA序列設(shè)計(jì)引物,體外克隆BmDichaete基因的ORF及不含有保守結(jié)構(gòu)域HMG-box的特異序列。將目的片段序列亞克隆到pET-28a-c(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重

7、組表達(dá)質(zhì)粒,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)宿主菌中,用IPTG誘導(dǎo)BmDichaete-pET-28a-c(+)/BL21表達(dá)目的蛋白。由于加了組氨酸標(biāo)簽,目的蛋白大小分別為32.3kD租17kD,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。該蛋白以包涵體的形式存在。IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BmDichaete蛋白的表達(dá)影響不大,但誘導(dǎo)溫度會(huì)顯著影響目的蛋白的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)最終采用0.4mMIPTG、37℃誘導(dǎo)5h來(lái)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。
　　 3,家蠶Bm

8、Dichacte蛋白抗體的制備
　　 以純化的BmDichaetc特異片段蛋白為抗原制備了抗體,并用飽和硫酸銨鹽析法純化,通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)為1:100000。
　　 4,家蠶BmDichaete基因的表達(dá)模式分析
　　 提取家蠶發(fā)育各時(shí)期和幼蟲(chóng)5齡3天各組織總RNA,利用RT-PCR技術(shù)分析BmDichaete基因在家蠶發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)BmDichaete在家蠶整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都有表達(dá)

9、,蛹后期表達(dá)量降低,化蛾時(shí)基本不表達(dá):BmDichaete基因在家蠶幼蟲(chóng)期的表達(dá)還具有組織特異性,主要在神經(jīng)、頭部、卵巢、后腸及絲腺中表達(dá)。
　　 提取家蠶胚胎發(fā)育各天的蛋白進(jìn)行westernblotting分析,發(fā)現(xiàn)BmDichaete基因在家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期持續(xù)的表達(dá)。
　　 5,家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期的RNAi
　　 通過(guò)dsRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù),對(duì)家蠶大造品種的胚胎進(jìn)行BmDichaete基因沉默。通過(guò)統(tǒng)計(jì)顯