家蠶GMCβ2基因的克隆、表達及功能初探.pdf

1、GMC基因家族(glucose-methanol-cholinegenefamily)是指存在于生物有機體中的一大類以黃素腺嘌呤二核苷(FAD)為輔酶的氧化還原酶類基因,此基因家族所表達的蛋白含有同源的骨架結構,被命名為GMC氧化還原酶家族(glucose-methanol-cholineoxidoreductasefamily)。這類基因最初在微生物中發(fā)現,大量存在于昆蟲和脊椎動物中,但在線蟲和高等的脊椎動物中很少或沒有發(fā)現此類基因。

2、GMC氧化還原酶功能各異,可催化不同的反應,現在至少可以劃分出11種功能,然而關于GMC基因家族的具體基因功能研究還不是很多。
　　 Iida(2007)的研究發(fā)現,昆蟲基因組中含有大量的GMC基因家族基因,在昆蟲中,此類基因家族的大多數基因成簇的串聯(lián)排布在高度保守的GMC基因簇中,這個基因簇包含在一個很大的內含子flotillin-2內。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物,其遺傳學、生理生化、病理學的研究已有大量報道,尤其家蠶基因組

3、學研究在近十年來更是長足發(fā)展,但家蠶GMC基因家族的研究卻幾乎還是個空白。通過分析,我們發(fā)現家蠶中存在43個GMC氧化還原酶類基因,而且它們在家蠶基因組中的分布情況與Iida研究中的昆蟲相一致。
　　 本研究是在家蠶基因組數據庫的基礎上,選取了家蠶GMC基因家族中的一個基因-BmGMCβ2作為研究對象,對其進行克隆、表達及功能初探,經以上研究鑒定該基因的功能。主要研究結果如下:
　　 1、BmGMCβ2基因的克隆及序列分

4、析
　　 基于家蠶基因組數據庫,設計引物并克隆了目的基因BmGMCβ2。通過生物信息學分析我們發(fā)現,BrnGMCβ2基因全長1875bp,編碼624個氨基酸。預測蛋白質分子質量為69.3kD,等電點(pI)為6.21。該基因位于家蠶16號染色體的scaf3058上,含GMC基因家族所共有的ADP-Bindingβ-α-β折疊結構域。進化分析表明,該基因是家蠶GMC基因家族β亞家族成員。
　　 2、BmGMCβ2基因的表達

5、特征分析
　　 利用RT-PCR技術分析BmGMCβ2基因在家蠶不同發(fā)育時期和不同組織的表達模式。結果顯示,BmGMCβ2基因在家蠶5齡盛食期表達量較高。在組織層面上,BmGMCβ2基因主要是在表皮、脂肪體和氣管中表達,且此基因的轉錄在組織分布上沒有性別差異。
　　 3、BmGMCβ2基因的原核表達和多克隆抗體制備
　　 將擴增好的帶有特定酶切位點的BmGMCβ2基因片段酶切后,亞克隆到表達載體pET-28a(+

6、)中,然后轉化到大腸桿菌BL21表達菌株中進行誘導表達,經SDS-PAGE電泳檢測,在69kD左右出現一條與預測蛋白大小相一致的較濃條帶,確定其為目的蛋白。目的蛋白經His-層析純化柱純化后制備多克隆抗體。然后用Westernblotting技術檢測原核表達的目的蛋白,在69kD左右處出現特異的雜交信號,說明制備的抗體具有良好的特異性,可用于下一步研究。
　　 4、GMCβ2蛋白在家蠶中的組織定位
　　 利用Wester

7、nblotting技術檢測GMCβ2蛋白在家蠶各組織中的分布情況,結果顯示,該蛋白主要在家蠶脂肪體中表達。然后我們還通過免疫組化的方法,在脂肪體組織中探測到了雜交信號,證實了該基因在家蠶脂肪體組織中的蛋白表達情況。
　　 5、BmGMCβ2基因的功能初探
　　 用病原微生物G-菌(沙雷氏菌,S.aureus)、G+菌(黑胸敗血菌,B.beauveria)和真菌(白僵菌,B.bassiana)添食家蠶后,利用熒光定量PCR