櫛孔扇貝CF-foxl2基因的克隆、表達(dá)模式及功能初探.pdf

1、FOXL2是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，迄今已在多個(gè)物種中獲得了該基因的序列，然而較深入和系統(tǒng)的研究?jī)H在高等哺乳動(dòng)物中進(jìn)行，并確定其參與哺乳動(dòng)物的卵巢早期發(fā)育、分化以及成體卵巢的功能維持，屬于雌性相關(guān)基因。目前，無(wú)脊椎動(dòng)物中該基因的系統(tǒng)研究還很有限，且尚未見(jiàn)該基因作為無(wú)脊椎動(dòng)物雌性特異基因的相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究以重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種——櫛孔扇貝（Chlamys farreri）為研究對(duì)象，克隆獲得了foxl2的cDNA全長(zhǎng)序列

2、，分析了它的序列特征；半定量RT-PCR揭示了增殖期櫛孔扇貝各組織中的空間表達(dá)；定量RT-PCR和原位雜交技術(shù)分析了該基因在個(gè)體發(fā)育過(guò)程及成體性腺周期中的表達(dá)特征；定量RT-PCR技術(shù)分析了外源17β-雌二醇對(duì)該基因表達(dá)的影響；初步探討了該基因在貝類中可能的功能。
　　 本研究獲得的櫛孔扇貝foxl2（Cf-foxl2） cDNA序列全長(zhǎng)1824bp,編碼369個(gè)氨基酸，具有保守的叉頭框DNA結(jié)合區(qū)。保守區(qū)C端含NTL（細(xì)胞核定

3、位信號(hào)）序列（RRRRRMKR），蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Cf-FOXL2叉頭框含3個(gè)α螺旋及2個(gè)翼狀結(jié)構(gòu)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示其主要在卵巢中表達(dá)；其次在肝臟中有很微弱地表達(dá)；在精巢及其他組織中無(wú)可見(jiàn)表達(dá)；初步顯示其在精卵巢中的二態(tài)性表達(dá)特征。
　　 定量RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，Cf-foxl2呈母源性表達(dá)；在幼蟲(chóng)結(jié)構(gòu)迅速建立的D形期幼蟲(chóng)表達(dá)量較高，之后隨著幼蟲(chóng)的發(fā)育，表達(dá)量顯著下降；至個(gè)體性別分化后表達(dá)量明顯上升。

4、原位雜交結(jié)果顯示陽(yáng)性信號(hào)在擔(dān)輪幼蟲(chóng)之前皆均勻分布；擔(dān)輪幼蟲(chóng)出現(xiàn)信號(hào)集中，主要集中在腹面的口凹附近，對(duì)稱存在于蟲(chóng)體兩側(cè)；D形幼蟲(chóng)時(shí)信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，除集中于內(nèi)臟團(tuán)外，在外套膜邊緣也有強(qiáng)信號(hào)出現(xiàn)，之后信號(hào)漸弱直至消失；當(dāng)個(gè)體發(fā)育到9mm幼貝時(shí)，此時(shí)從性腺組織學(xué)上剛剛可以分辨雌雄，Cf-foxl2陽(yáng)性信號(hào)僅在雌性生殖細(xì)胞及周?chē)捏w細(xì)胞中出現(xiàn)，在同時(shí)期的精巢中未見(jiàn)表達(dá)；暗示該基因可能是櫛孔扇貝雌性性別表型形成的早期標(biāo)記基因，可能參與扇貝卵巢的分

5、化。
　　 比較Cf-foxl2mRNA在櫛孔扇貝成體性腺發(fā)育周期中精卵巢的定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cf-foxl2在各時(shí)期卵巢中的表達(dá)均顯著高于同時(shí)期精巢中的表達(dá)，呈明顯的性別二態(tài)性表達(dá)模式，其中增殖期卵巢是精巢表達(dá)量的63倍。在卵巢中，增殖期卵巢的表達(dá)量明顯高于生長(zhǎng)期和成熟期，前者是后兩者的3倍，該表達(dá)規(guī)律與小鼠及青鳉等物種中foxl2的表達(dá)規(guī)律類似，推測(cè)與其在卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用相關(guān)相關(guān)；在精巢中，Cf-foxl2mRN

6、A僅在成熟期有非常微弱的表達(dá)，增殖期與生長(zhǎng)期的精巢中無(wú)明顯表達(dá)。成體性腺的原位雜交結(jié)果顯示，Cf-foxl2的陽(yáng)性信號(hào)在各時(shí)期卵巢中的分布位點(diǎn)與其在幼貝雌性性腺中相同，但在成熟個(gè)體的精巢中除精子外的其它細(xì)胞（生殖細(xì)胞和體細(xì)胞）中也有微弱信號(hào)出現(xiàn)；有趣的是，與胚胎、幼蟲(chóng)和幼體不同，陰性探針在成體兩性性腺中均有表達(dá)信號(hào)，推測(cè)成體性腺中可能存在反義RNA，以調(diào)控foxl2基因的表達(dá)。
　　 采用閉殼肌注射外源17β-雌二醇的方法，檢測(cè)

7、其對(duì)Cf-foxl2表達(dá)的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，成體卵巢與精巢中的Cf-foxl2表達(dá)量較對(duì)照組都有明顯提高（p＜0.05），推測(cè)17β-雌二醇對(duì)該基因有反饋?zhàn)饔谩?br>　　 綜上，在結(jié)構(gòu)上，Cf-foxl2基因的叉頭框與已報(bào)道其它物種的foxl2基因叉頭框部位高度保守；其在個(gè)體發(fā)育中的表達(dá)圖式顯示該基因呈母源性表達(dá)，是卵巢表型形成的早期標(biāo)記基因；其在成體中的表達(dá)模式與已報(bào)道的脊椎動(dòng)物一樣，呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性表達(dá)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，外源17β-雌二