櫛孔扇貝Cf-dmrt4-like基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、對動物性別決定和性腺發(fā)育相關(guān)基因的研究是發(fā)育生物學(xué)重要的研究內(nèi)容之一,也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中性別人工控制的理論基礎(chǔ)。Dmrt基因最早是在果蠅和線蟲中發(fā)現(xiàn),隨后在從無脊椎動物到哺乳動物的多種物種中均可獲得dmrt基因,該家族蛋白享有共同的DM保守結(jié)構(gòu)域,并在一定程度上顯示了功能的保守性。在脊椎動物中它們參與了諸如性別決定、性腺分化和發(fā)育以及個體發(fā)育、組織功能維持等生物學(xué)過程。
　　 本文采用同源克隆技術(shù),從櫛孔扇貝精巢中克隆了dmrt基

2、因家族中的Cf-dmrt4-like基因的全長cDNA及其2個拼接片段Cf-dmrt4a-like和Cf-dmrt4b-like,分析了它們的序列特征;利用半定量RT-PCR、相對定量qRT-PCR技術(shù)、整體和組織原位雜交方法,分析了該基因在櫛孔扇貝胚胎發(fā)育、性腺發(fā)育和各組織中的時空表達(dá)特征和規(guī)律;進(jìn)一步采用RNAi技術(shù),通過體外注射Cf-dmrt4-like dsRNA到櫛孔扇貝生長期性腺中,定量PCR檢測了目的基因在體內(nèi)的表達(dá)。

3、r>　　 櫛孔扇貝Cf-dmrt4-like基因的cDNA全長為2312 bp,ORF 1110 bp,編碼369個氨基酸;其氨基酸序列具有DMRT蛋白特有的DM保守結(jié)構(gòu)域,且在C端擁有DMRT4和DMRT5蛋白共有的DMA保守結(jié)構(gòu)域,以及DMRT4和DMRT5蛋白特有的短保守序列(short motif 1)。序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,Cf-DMRT4-LIKE蛋白與其它物種的DMRT4蛋白的相似性最高,且首先與DMRT4蛋白聚類

4、,這一結(jié)果也說明了Cf-dmrt4-like基因在進(jìn)化上的保守性。本實(shí)驗(yàn)還克隆獲得了Cf-dmrt4a-like基因cDNA片段,長1638bp,編碼143個氨基酸以及Cf-dmrt4b-like基因cDNA片段,長1641bp,編碼104個氨基酸,初步分析其為Cf-dmrt4-like基因的拼接產(chǎn)物。
　　 半定量RT-PCR,Cf-dmrt4-like mRNA在雌性成體組織的鰓、外套膜、腎、閉殼肌、性腺及雄性鰓和性腺中表達(dá)

5、。熒光定量qRT-PCR分析結(jié)果顯示,該基因在各發(fā)育期的雌雄兩性性腺中均有表達(dá),且成熟期精巢中的表達(dá)量與其余各期精巢中的表達(dá)量呈顯著性差異,約是其它時期的20倍;然而各期卵巢以及增殖期與生長期精巢中的表達(dá)量未顯示顯著性差異,表明該基因參與了櫛孔扇貝兩性性腺的發(fā)育,尤其在成熟期精巢的發(fā)育中起重要的作用。原位雜交結(jié)果顯示,Cf-dmrt4-like mRNA分布在各期卵巢的卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞的胞質(zhì)和核中,其中成熟期卵巢各期生卵細(xì)胞中的陽性信

6、號略強(qiáng)于增殖期和生長期;Cf-dmrt4-like mRNA也定位于各期精巢的精原、精母和精細(xì)胞中,成熟期各期生精細(xì)胞中的陽性信號更加明顯;在性腺的體細(xì)胞中未見目的基因的表達(dá)。上述結(jié)果暗示Cf-dmrt4-like基因參與了生殖細(xì)胞的分化和功能維持。
　　 胚胎和幼蟲的半定量RT-PCR和熒光定量qRT-PCR結(jié)果證實(shí),Cf-dmrt4-like基因在未受精卵、受精卵、卵裂期胚胎、各期幼蟲中均有表達(dá)。未受精卵Cf-dmrt4-l

7、ike基因的表達(dá)量顯著高于各期胚胎的表達(dá)量,D形幼蟲的表達(dá)量顯著高于殼頂幼蟲和附著前幼蟲的表達(dá)量(p＜0.05)。原位雜交結(jié)果顯示,Cf-dmrt4-like基因的藍(lán)色陽性信號主要集中在未受精卵和早期胚胎的中間部位,隨著發(fā)育的進(jìn)行,信號相繼集中在幼蟲的外套膜和鰓處,暗示該基因參與櫛孔扇貝鰓和外套膜組織的早期構(gòu)建,進(jìn)一步因其在成體的鰓和外套膜組織中也有表達(dá),推測其在櫛孔扇貝鰓和外套膜等組織的構(gòu)建和功能維持中發(fā)揮一定的作用。Cf-dmrt4