水稻螟蟲嗅覺相關(guān)蛋白基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)，屬鱗翅目螟蛾科，是我國(guó)水稻上一種重要的害蟲。昆蟲嗅覺在感受氣味物質(zhì)、尋找寄主、交配等方面起著重要的作用。在對(duì)二化螟觸角感器有一定了解的基礎(chǔ)上，有必要對(duì)其嗅覺識(shí)別的分子機(jī)制進(jìn)行研究，闡明嗅覺反應(yīng)的本質(zhì)原因，找到新的作用靶標(biāo)，為篩選、研究安全高效的引誘劑、趨避劑等提供幫助；同時(shí)昆蟲作為良好的模式生物，對(duì)其嗅覺的研究能夠有助于深入研究人類嗅覺的本質(zhì)。本研究通過RT-PCR、RACE克

2、隆得到了嗅覺相關(guān)的蛋白基因，原核系統(tǒng)表達(dá)純化了蛋白、并對(duì)蛋白的功能進(jìn)行了研究。獲得的主要結(jié)果如下： 1.利用RT-PCR和RACE方法得到了鱗翅目螟蛾科昆蟲二化螟gobp2全長(zhǎng)基因。該基因最大編碼框?yàn)?89個(gè)核苷酸，編碼162個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的分子量為18.192kDa，等電點(diǎn)為5.08，前21個(gè)編碼氨基酸為信號(hào)肽序列，具有氣味結(jié)合蛋白的典型特征。成功構(gòu)建了CsupGOBP2的原核表達(dá)載體pET30a/CsupGOBP2，并在

3、大腸桿菌中成功表達(dá)，經(jīng)過親和層析和凝膠過濾獲得高純度的蛋白，免疫家兔制備了多克隆抗體。通過RT-PCR和Western blot方法對(duì)二化螟gobp2基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果表明GOBP2在二化螟雌雄蟲觸角中都表達(dá)且表達(dá)量相同。 以(N-pheny1-1-naphthylamine)1-NPN為熒光探針，利用熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法對(duì)純化蛋白的功能進(jìn)行了分析，結(jié)果表明1-NPN結(jié)合在蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，來自水稻揮

4、發(fā)物和性信息素成分的各種氣味分子對(duì)1-NPN/GOBP2復(fù)合物中的1-NPN有不同的競(jìng)爭(zhēng)能力，cis-11-hexadecenal和Laurinaldehyd兩種醛類物質(zhì)對(duì)1-NPN競(jìng)爭(zhēng)能力最強(qiáng)，表明在所檢測(cè)的17種物質(zhì)中這兩種物質(zhì)對(duì)GOBP2結(jié)合能力最強(qiáng)。 2.應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中在昆蟲細(xì)胞Tn中表達(dá)了二化螟GOBP2蛋白，用His-Tag單抗及兔多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析結(jié)果證實(shí)表達(dá)的蛋

5、白為His與GOBP2的融合蛋白。 3.克隆了大螟、稻縱卷葉螟gobp2基因部分cDNA序列，對(duì)CsupGOBP2、SinfGOBP2、CmedGOBP2的序列分析結(jié)果表明該基因在一定程度上反映了鱗翅目昆蟲親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，與形態(tài)上的分科結(jié)果是一致的。 4.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了二化螟gobpl基因全長(zhǎng)序列，該基因最大編碼框?yàn)?22個(gè)核苷酸，編碼173個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的分子量為20.039kDa，等電點(diǎn)為4

6、.84。推斷的信號(hào)肽為前22個(gè)氨基酸。對(duì)3'末端的擴(kuò)增首次發(fā)現(xiàn)該基因的3'UTR可能存在長(zhǎng)度不同的轉(zhuǎn)錄本；成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pET30a/CsupGOBP1，制備了兔多克隆抗體，利用熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)該蛋白對(duì)不同氣味分子的檢測(cè)結(jié)果表明所檢測(cè)的氣味分子對(duì)熒光探針1-NPN的競(jìng)爭(zhēng)能力都很弱，說明對(duì)蛋白的結(jié)合能力較弱。 5.利用RT-PCR和RACE方法成功克隆了二化螟pbp2基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)基因組序列進(jìn)行了擴(kuò)增。該

7、基因最大編碼框?yàn)?98個(gè)核苷酸，編碼165個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的分子量為18.554 kDa，等電點(diǎn)為4.71。PBP2序列片段經(jīng)Signal3.0分析表明該蛋白推斷的信號(hào)肽及最大可能的切割位點(diǎn)為前21個(gè)氨基酸。 對(duì)pbp2基因組的分析表明該基因具有相同的3個(gè)外顯子-2個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，僅在長(zhǎng)度上存在較大差異。外顯子1和外顯子2在昆蟲PBP基因進(jìn)化中大小一致，而外顯子3則變異較大。同時(shí)內(nèi)含子的插入位點(diǎn)在該基因中也是很保守的，第1、2個(gè)

8、內(nèi)含子分別在編碼蛋白的Glu22、Ala82(Ala81)位氨基酸之后插入，但插入的內(nèi)含子的長(zhǎng)度變異較大(76bp-437 bp、104 bp-1251 bp)。 構(gòu)建了pET30a/CsupPBP2原核表達(dá)載體，割膠回收的蛋白免疫家兔制備了多克隆抗體，對(duì)純化的蛋白利用內(nèi)源熒光的變化對(duì)二化螟三種信息素成分Z11-16:Ald、Z9:16:Ald、Z13-18:Ald的測(cè)定結(jié)果表明Z11-16:Ald對(duì)蛋白內(nèi)源熒光有明顯的淬滅作用

9、，而Z9:16:Ald、Z13-18:Ald對(duì)熒光的淬滅作用不大。 6.通過已報(bào)道的其它昆蟲的基因序列信息設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增了二化螟、大螟的OR受體基因，結(jié)果表明二化螟、大螟中有該受體基因的表達(dá)，與鱗翅目其它種昆蟲序列相似性很高，在整個(gè)昆蟲種群中高度保守。在原核系統(tǒng)中的表達(dá)沒有成功。 7.構(gòu)建了二化螟觸角cDNA文庫(kù)，酶切鑒定及通過PCR方法從文庫(kù)中篩選CsupGOBP1、CsupGPBP2、CsupPBP2基因的結(jié)果顯示