文蛤MmPlg基因和MmCtl基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、文蛤是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，但近年來養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)了許多嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“瓶頸”問題，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。纖溶酶和組織蛋白酶 L等在動(dòng)物的生長發(fā)育中具有重要作用。研究和了解文蛤的生長發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)理，對(duì)文蛤人工育苗和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本文以文蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，研究內(nèi)容主要分為以下5個(gè)部分：
　　第1部分：通過 RACE技術(shù)從文蛤體內(nèi)克隆到文蛤纖溶酶原 MmPlg基因和文蛤組織蛋白酶 L Mm

2、Ctl基因，井對(duì)它們的核酸序列和編碼的蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；
　　結(jié)果如下：
　?。?）文蛤 MmPlg基因序列全長921 bp，包含1個(gè)819 bp的開放閱讀框，編碼的蛋白含272個(gè)氨基酸殘基，其中前16個(gè)為信號(hào)肽序列。MmPlg蛋白的理論分于量為28.7 kD，等電點(diǎn)為6.42，包含由組氨酸（His77）、大冬氨酸（Asp126）和絲氨酸（Ser220）組成的典型絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)MmPlg和

3、單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）和櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的纖溶酶相似度較高。
　?。?）文蛤 MmCtl基因序列全長1304 bp，包含1個(gè)1005 bp的開放閱讀框，推導(dǎo)的蛋白含334個(gè)氨基酸殘基，其中前16個(gè)為信號(hào)肽序列。MmCtl蛋白的理論分于量為37.5 kD，理論等電點(diǎn)為5.27.利用Conserved Domain SearCh工具分析MmCtl蛋白序列，結(jié)果表明該酶是 Peptid

4、ase C1A亞家族成員，含有木瓜蛋白酶特異的活性催化位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)。
　　第2部分：以文蛤-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)分析了MmPlg基因和MmCtl基因在文蛤發(fā)育不同時(shí)期（擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝）mRNA表達(dá)量的變化；利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)分析了MmPlg基因和MmCtl基因在文蛤成貝不同組織（肌肉、外套膜、鰓、腸和肝胰腺）中的mRNA表達(dá)量變化。
　　結(jié)果如下：
　　

5、（1）組織定量結(jié)果顯示結(jié)果顯示 MmPlg在各個(gè)組織中都有表達(dá)，而腸的表達(dá)量則明顯高于其它四個(gè)組織，是鰓中表達(dá)量的大約2倍；發(fā)育定量結(jié)果顯示在擔(dān)輪幼蟲和D型幼蟲時(shí)期，MmPlg的表達(dá)量變化不明顯，到殼頂幼蟲時(shí)期，MmPlg的表達(dá)量大幅度上調(diào)，文蛤發(fā)育成稚貝后，MmPlg表達(dá)量稍有下調(diào)，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩個(gè)時(shí)期。經(jīng)分析推測 MmPlg可能參與文蛤?qū)I養(yǎng)成分的消化；
　?。?）組織定量結(jié)果顯示結(jié)果顯示 MmCtl在各個(gè)組織中都有表達(dá)，

6、肝胰腺的表達(dá)量最高；發(fā)育定量結(jié)果顯示，隨著文蛤發(fā)育 MmCtl表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢，從擔(dān)輪幼蟲到D型幼蟲 MmCtl表達(dá)量稍有上升，到殼頂幼蟲期表達(dá)量大約為擔(dān)輪幼蟲期的20倍，至稚貝期表達(dá)量達(dá)到最高。經(jīng)分析推測 MmCtl可能通過細(xì)胞凋亡等機(jī)制參與了文蛤幼蟲的發(fā)育過程。
　　第3部分：構(gòu)建了文蛤 MmPlg基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌 DE3宿主菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá)，井對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化，用純化后的DsbA-MmPlg融合蛋

7、白免疫新西蘭大白兔，制備了抗血清。
　　結(jié)果如下：獲得的融合蛋白 DsbA-MmPlg的分于量為52.7 kD，包涵體表達(dá)，用純化后的融合蛋白制備抗血清，Western Blot結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的抗血清具有較好的特異性。
　　第4部分：對(duì)文蛤 MmCtl基因進(jìn)行了原核表達(dá)，純化了融合蛋白，井制備了融合蛋白 DsbA-MmCtl的抗血清。
　　結(jié)果如下：獲得的融合蛋白 DsbA-MmCtl的分于量為60.5 kD，包涵