番茄SlAN2基因的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、花青素是類黃酮途徑的產(chǎn)物之一，近年來受到越來越多的關(guān)注?；ㄇ嗨氐姆e累受一系列環(huán)境和發(fā)育信號(hào)的誘導(dǎo)?；ㄇ嗨厥且环N抗氧化物質(zhì)和光保護(hù)屏障，同時(shí)它在光保護(hù)、抗逆、授粉以及種子傳播等許多生理過程中都發(fā)揮著重要的作用。另外，人類膳食中的花青素對(duì)健康也十分有益?；ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平?；ㄇ嗨睾铣上嚓P(guān)的結(jié)構(gòu)基因受轉(zhuǎn)錄復(fù)合體激活，這些復(fù)合體由R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD重復(fù)蛋白組成。SlAN2編碼一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄

2、因子，調(diào)控番茄花青素的合成。
　　植物遭受非生物脅迫時(shí)，體內(nèi)代謝失衡會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)大量積累。當(dāng)脅迫加劇時(shí)，過量積累的ROS會(huì)對(duì)植物造成一系列的損傷。幸運(yùn)的是，植物進(jìn)化出了許多適應(yīng)機(jī)制來對(duì)抗ROS的傷害，這些機(jī)制包括酶促和非酶促抗氧化防御體系。類胡蘿卜素，抗壞血酸，谷胱甘肽以及類黃酮等都屬于非酶促的抗氧化物質(zhì)，它們可以清除ROS從而保護(hù)植物免受損害?；ㄇ嗨鼐褪且环N抗氧化物質(zhì)，它的抗氧化性能主要?dú)w功于糖基上的羥基。番茄是研究果

3、實(shí)成熟的模式植物，然而SlAN2與果實(shí)成熟的關(guān)系還不清楚。
　　本研究從番茄中克隆得到SlAN2基因，并對(duì)該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行分析，主要結(jié)果如下:
　　(1)分離得到SlAN2基因，包含一個(gè)828個(gè)堿基的開放閱讀框，能編碼275個(gè)氨基酸。
　　(2)將SlAN2-GFP融合蛋白在洋蔥表皮中瞬時(shí)表達(dá)，觀察到該融合蛋白定位在細(xì)胞核中。
　　(3)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)表明SlAN2的轉(zhuǎn)錄水平在莖中最高，在

4、葉、花和根中水平適中，在果實(shí)中最低。SlAN2的表達(dá)水平受低溫以及甲基紫晶(MV)的誘導(dǎo)上調(diào)。
　　(4)構(gòu)建正、反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌進(jìn)行番茄和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和正義轉(zhuǎn)基因煙草植株。對(duì)有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果證明成功地獲得了正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和正義轉(zhuǎn)基因煙草植株。正義轉(zhuǎn)基因番茄葉片的花青素含量升高，為野生型番茄的2.2-3.2倍，過表達(dá)SlAN2的煙草葉片花青素

5、含量升高了100-284倍。
　　(5)與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草通過維持更高的葉綠素含量，凈光合速率和光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率來抵御低溫脅迫。另外，在遭受低溫脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的離子滲透更少，ROS水平更低，非酶促抗氧化性能更高。轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)由MV誘發(fā)的氧化脅迫的抗性也更強(qiáng)。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草在遭受氧化脅迫時(shí)，葉綠素含量降低的更少，離子滲透更少，能維持更高的光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率。這些結(jié)果表明，SlAN2在煙草中的

6、過量表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因煙草中花青素大量積累，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫和氧化脅迫的抗性。
　　(6)與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄在抵御高溫脅迫時(shí)，能夠維持更高的鮮重、凈光合速率和光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率。另外，與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄在遭受高溫脅迫時(shí)，有更強(qiáng)的非酶促抗氧化性能，能維持更低的ROS水平和更高的PSⅡ反應(yīng)中心D1蛋白含量。這些結(jié)果說明，SlAN2在抵御高溫脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用。
　　(7)過表達(dá)SlAN2的番茄果實(shí)