番茄Aux-IAA基因的克隆與功能分析.pdf

1、生長素是一類重要的植物激素，它與植物生長發(fā)育的許多過程相關(guān)。在細(xì)胞水平上，生長素影響細(xì)胞的伸長、分裂和分化。在個(gè)體水平上，生長素在植物的頂端優(yōu)勢、側(cè)根／不定根的形成、植物的向性反應(yīng)、果實(shí)的座果和發(fā)育、維管組織的分化和胚的形成等方面是都是必需的。由于生長素具有這些多樣化的調(diào)節(jié)活性，因此，生長素、生長素反應(yīng)以及生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起了人們極大的興趣。已有的研究成果表明，盡管生長素可以通過直接影響細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的功能來調(diào)節(jié)一些細(xì)胞反應(yīng)，但生長素

2、更多是通過調(diào)控基因表達(dá)來影響植物的發(fā)育和其他的一些反應(yīng)。Aux／IAA、SAUR和GH3等是三類主要的生長素早期誘導(dǎo)表達(dá)的基因，生長素能夠誘導(dǎo)這三類基因中的多數(shù)基因快速、特異、并且在不需要新的蛋白質(zhì)生物合成的條件下表達(dá)，這些基因也被認(rèn)為是生長素誘導(dǎo)的原初表達(dá)基因。在這三類基因中，Aux／IAA基因家族的研究相對較多。 以擬南芥為模式植物的植物生物化學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究也已經(jīng)證實(shí)Aux／IAA蛋白在生長素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物

3、的生長發(fā)育中起著重要的作用。擬南芥Aux／IAA基因突變體表現(xiàn)出與生長素直接相關(guān)的發(fā)育表型的改變，包括改變植株的向光性、向地性、頂端優(yōu)勢、根的形成、莖／下胚軸的伸長、葉片的展開以及黑暗條件下葉片的形成等。在氨基酸序列上，番茄Aux／IAA蛋白與擬南芥Aux／IAA蛋白有比較大的差異，且番茄果實(shí)為鮮果，生理學(xué)的研究表明生長素與番茄果實(shí)的座果、膨大和成熟等有著密切的關(guān)系，外源生長素能促進(jìn)番茄果實(shí)的單性結(jié)實(shí)，因此以番茄為模式植物研究生長素信號(hào)

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Aux／IAA基因的生物學(xué)功能，對全面了解生長素在植物根、莖、葉、花、果等的生長、發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，揭示番茄單性結(jié)實(shí)可能的分子機(jī)理，闡明生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜分子機(jī)制具有重要的理論意義。對番茄生產(chǎn)中合理利用生長素、生長素類似物以及生長素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制物等調(diào)控番茄植株的生長發(fā)育、果實(shí)的座果、果實(shí)的發(fā)育成熟等也具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。 本研究的目的：比較全面的分析番茄Aux／IAA基因的進(jìn)化和組織／器官表達(dá)情況，初步

5、預(yù)測這些基因可能的功能；利用轉(zhuǎn)基因手段分析三個(gè)Aux／IAA基因，即SlIAA3，SllAA4和SlIAAl4，在番茄生長和發(fā)育過程中的生物學(xué)功能，從分子水平初步闡明它們可能的作用機(jī)制；初步分析這三個(gè)基因在生長素效應(yīng)中發(fā)揮的作用，創(chuàng)建一些應(yīng)用于生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的材料；創(chuàng)造一些單性結(jié)實(shí)的材料，應(yīng)用于果實(shí)單性結(jié)實(shí)分子機(jī)理的研究。 1.利用生物信息學(xué)手段從核酸數(shù)據(jù)庫中獲得22個(gè)潛在的番茄Aux／IAA基因，利用生物信息學(xué)手段對這些基

6、因的結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。 2.RT-PCR分析了番茄11個(gè)Aux／IAA基因在不同組織／器官、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期以及不同條件下的基因表達(dá)特性，結(jié)果表明SIlAA4在所有的分析材料中表達(dá)量均很高，而其他的基因在不同組織／器官、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期以及不同條件下的基因表達(dá)顯示出不同的表達(dá)特異性。 3.利用RACE技術(shù)克隆了番茄7個(gè)Aux／IAA基因的全長cDNA和一個(gè)Aux／IAA基因的5’端。獲得了SIlAA3基因的基因

7、組DNA序列，DNA序列分析結(jié)果表明SIlAA3基因由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成。 4.利用RFLP分析了SlIAA3、SllAA4、SlIAA14三個(gè)基因在M82和LA716兩個(gè)番茄種中的基因多態(tài)性，結(jié)果表明這三個(gè)基因在這兩個(gè)種中有明顯的多態(tài)性，且結(jié)果還顯示SlIAA3、SIlAA4基因?yàn)閱慰截惢颉⒁子谕哑渌腁ux／IAA基因區(qū)分，并且這兩基因在兩個(gè)種中比較保守。 5.利用76個(gè)IL群體將SllAA3和SllA

8、A4基因分別定位在番茄第9染色體的9-G區(qū)域和第4染色體的4-G區(qū)域，分別與番茄hi(hilara突變)基因和e(entire突變)基因在同一區(qū)域。 6.構(gòu)建了SlIAA3、SllAA4、SllAA4三個(gè)基因的超量表達(dá)、反義抑制和RNAi植物遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得番茄轉(zhuǎn)基因植株。 7.轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SlIAA3基因與番茄幼苗根系的發(fā)育相關(guān)，RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗初生根的伸長受到抑制。幼苗

9、水培結(jié)果也顯示，反義抑制和IWAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗均有短而弱的根系。 8.轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SIlAA4明顯影響番茄葉片的形態(tài)建成。超量表達(dá)、反義抑制和RNAi的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出葉片的復(fù)雜性降低，其中以正義和RNAi的效果明顯，部分轉(zhuǎn)基因植株甚至全株葉片均為單葉，葉片的形態(tài)特征與entire突變體及其相似。 9．轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SIlAA14也參與番茄幼苗根的形態(tài)建成，RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗初生根的伸長被抑