番茄ICE1a基因的分離與功能分析.pdf

1、在自然界中，植物不可避免地遭受各種環(huán)境因子的刺激，例如低溫，干旱和鹽漬脅迫。在長期的進化過程中植物形成了響應(yīng)脅迫信號和提高自身抗性的應(yīng)變機制，它們通過調(diào)節(jié)抗性基因的表達來引起生理生化反應(yīng)，在體內(nèi)建立新的物質(zhì)和能量代謝平衡，從而在環(huán)境改變后得以存活。
　　 低溫冷害作為一種常見的非生物脅迫，它影響植物的生長，生存和時空分布。經(jīng)常會對作物生長和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來負面的影響。低溫冷害對于植物細胞的直接影響是使之代謝緩慢，間接影響是引起滲透脅

2、迫和氧化脅迫等。溫帶植物在遭受嚴寒時，自身會主動引起生理生化反應(yīng)，這一過程稱為冷馴化或冷鍛煉，進而提高其耐冷性。ICE轉(zhuǎn)錄因子是植物冷馴化過程中的一個關(guān)鍵“開關(guān)”，它響應(yīng)低溫信號，并通過調(diào)控CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子進而激活下游COR(cold-regulated)基因的表達，從而調(diào)節(jié)植物的耐低溫能力。
　　 目前關(guān)于ICE基因的研究多集中在擬南芥，小麥等耐冷植物中，對于冷敏感植物番茄的研究較少。番茄是重要的蔬菜作物，分布廣泛，

3、具有重要的經(jīng)濟和社會效益。本研究從番茄葉片中克隆到一個新的ICE1基因，對其進行了表達和功能分析，具體結(jié)果如下:
　　 (1)利用同源克隆的方法分離了番茄中一個新的MYC類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，并命名為SlICE1a，GenBank注冊號為JX625139。該基因ORF為1596bp，編碼一條531個氨基酸的多肽，預(yù)測分子量為58.3kDa。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中包含了保守的bHLH和ACT-Like結(jié)構(gòu)域，以及絲氨酸富集區(qū)和潛在的SUMO

4、結(jié)合位點。
　　 (2)將SlICE1a與GFP融合后在洋蔥表皮細胞瞬時表達發(fā)現(xiàn)，SlICE1a蛋白定位于細胞核中;通過與GAL4-BD融合后在酵母中表達發(fā)現(xiàn)，SlICE1a具有轉(zhuǎn)錄激活能力，且激活結(jié)構(gòu)域位于蛋白的N末端。
　　 (3)利用熒光定量PCR的方法對SlICE1α基因在番茄中的表達特性進行了研究。結(jié)果表明，SlICE1α基因在葉片中表達量高于其它器官;轉(zhuǎn)錄水平受到低溫、氧化、干旱以及高鹽等非生物脅迫和ABA等

5、信號分子的誘導(dǎo)表達，所以我們認為SlICE1a可能在植物響應(yīng)脅迫信號過程中起重要作用。
　　 (4)構(gòu)建由35S啟動子驅(qū)動SlICE1α的植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)卡那霉素篩選后進一步RT-qPCR分析，選取了表達量不同的三個株系(L8，10，26) T3代植株進行后續(xù)試驗。在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因植株表型沒有發(fā)生改變。
　　 (5)與野生型植株相比，過表達SlICE1a一定程度上提高了煙草

6、的冷馴化能力，并且顯著提高了抵御滲透脅迫，鹽脅迫和氧化脅迫的能力。過表達SlICE1a基因煙草在脅迫處理時可以激活并提高下游CBF/DREB以及多個逆境響應(yīng)基因的表達，尤其是與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)的基因。轉(zhuǎn)基因植株積累了更多的游離型脯氨酸和可溶性糖，來維持細胞滲透平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，清除了更多的活性氧物質(zhì)，有利于維持細胞膜的穩(wěn)定性，進而降低了環(huán)境劇變引起的滲透和氧化傷害，提高了其抗逆性。
　　 (6)分析發(fā)現(xiàn)Sl0CE1a可以結(jié)合

7、下游SlCBF1和SlCBF3的啟動子上的MYC特異序列，說明在冷敏感作物番茄中，同樣存在重要的ICE-CBF低溫信號通路。由于過表達番茄ICE1和CBF轉(zhuǎn)錄因子都能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的耐低溫能力，我們認為位于番茄CBF下游的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因可能是導(dǎo)致番茄對低溫敏感的決定性因素。
　　 這些研究結(jié)果，不僅使我們進一步的了解了ICE轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答非生物脅迫中的重要作用，并且對于通過基因工程手段改良植物的抗逆性具有一定的理論和實踐