番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、光是植物光合作用的唯一能源，是植物生命活動的基礎(chǔ)。然而，當(dāng)植物吸收的光能過剩，超過其電子傳遞所需時，過剩光能便會造成光合效率和光合功能的降低，嚴(yán)重時還會發(fā)生光氧化破壞。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了多種光保護(hù)機制，可將過剩激發(fā)能對光合機構(gòu)的損傷減小到最低程度，其中葉黃素循環(huán)被認(rèn)為在植物防御光氧化破壞中起著重要作用。所謂的葉黃素循環(huán)是指植物吸收的光能過剩時，雙環(huán)氧的紫黃質(zhì)(V)在紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的催化下，經(jīng)過中間物單環(huán)氧的花藥黃質(zhì)

2、(A)轉(zhuǎn)化為無環(huán)氧的玉米黃質(zhì)(Z)；在暗處，則在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向進(jìn)行，將Z經(jīng)A重新環(huán)氧化為V，形成一個循環(huán)。其中紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZE)是該循環(huán)的關(guān)鍵酶。因此，弄清葉黃素循環(huán)的功能以及該循環(huán)的調(diào)控機理具有非常重要的意義。 本文以番茄(中蔬四號)為材料，利用RT-PCR克隆了番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因(LeZE)，分析了該基因在番茄中的表達(dá)特征。構(gòu)建LeZE原核表達(dá)載體，制備抗體

3、，做Western bloaing，研究了該基因在蛋白水平的表達(dá)。構(gòu)建了LeZE基因的正義和反義表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化番茄，探討了LeZE基因過量表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植株耐低溫弱光和強光脅迫能力的影響。主要結(jié)果如下： 1．根據(jù)已知序列設(shè)計特異引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片中克隆了番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的cDNA全序列。測序結(jié)果顯示，番茄ZE的cDNA全長2284 bp，在5’端有一段29 bp的非編碼區(qū)，第2037～2039個堿基處

4、為該基因的終止密碼子TAA，其后有一段245個堿基的非編碼區(qū)；該基因的編碼區(qū)為2010 bp，推測其編碼669個氨基酸。該基因被命名為LeZE。 2．同源序列比較發(fā)現(xiàn)，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶的氨基酸序列與馬鈴薯、煙草、胡蘿卜、葡萄、菊花和杏同源性較高，分別為96.1％、89.7％、75％、74％、72.5％和71.2％；但與水稻的同源性則較低，僅為66.6％。 3．提取番茄不同部位(葉片、花瓣、莖、根和果實)總RNA，以Le

5、ZE3’端約400 bp序列為探針，進(jìn)行Northern雜交。結(jié)果表明LeZE基因在葉片中表達(dá)量最高，在果實和莖中表達(dá)量較低，而在根和花瓣中幾乎不表達(dá)。此外，LeZE基因的表達(dá)不受光強和溫度的誘導(dǎo)，而是受晝夜節(jié)律的影響。 4．將獲得的番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因與原核表達(dá)載體PET-30a重組，構(gòu)建原核表達(dá)載體。以原核表達(dá)所得重組蛋白注射小鼠，制備抗體。分別對低溫弱光和強光處理的番茄蛋白進(jìn)行了Western雜交分析。結(jié)果表明，LeZ

6、E在蛋白水平的表達(dá)始終處在同一水平，基本不受光強和溫度的影響。 5．將獲得的番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因與含有35S啟動子的PBI121載體重組，構(gòu)建了正義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)入番茄中，通過1％的卡那霉素篩選，獲得了番茄轉(zhuǎn)基因苗。用Northern雜交進(jìn)行檢測，獲得了轉(zhuǎn)正義．LeZE植株。 Northern和Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義基因株系的LeZE的RNA水平和蛋白水平與野生型相比都明顯增高。

7、對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄兩個株系分別進(jìn)行強光及低溫弱光處理。在脅迫處理過程中野生型和轉(zhuǎn)正義基因株系的NPQ及葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+z)/(V+A+Z)都增加，但野生型較轉(zhuǎn)正義基因株系的NPQ和(A+Z)/(V+A+Z)增加更加明顯。結(jié)果表明，在低溫弱光及強光脅迫條件下，依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過剩激發(fā)能，而轉(zhuǎn)基因株系比野生型耗散能力下降；強光處理過程中，與野生型相比轉(zhuǎn)正義基因株系的FV/Fm降低更明顯，且野生型的Fv/Fm恢復(fù)較

8、快，轉(zhuǎn)基因株系的Fv/Fm恢復(fù)較慢。低溫弱光處理時，野生型和轉(zhuǎn)基因株系Fv/Fm降低程度基本相同，但恢復(fù)過程中野生型的Fv/Fm恢復(fù)較快，這表明LeZE的過量表達(dá)加重了PSH的光抑制程度，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因番茄的PSⅡ反應(yīng)中心受傷害較嚴(yán)重；強光脅迫6h和12h，野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率降低非常顯著，低溫弱光處理6h和12h，野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率都降低，但下降程度不如強光處理下的明顯。這表明由于LeZE的過量表達(dá)降低了低溫弱

9、光和強光脅迫下放氧復(fù)合體的穩(wěn)定性，使光合機構(gòu)所受到的傷害加重。玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因在RNA水平上的表達(dá)量與合成新的有活性的ZE蛋白有關(guān)。因此轉(zhuǎn)正義基因株系中LeZE的過量表達(dá)使其RNA的表達(dá)量急劇上升，有活性的ZE蛋白含量隨之增加，從而使玉米黃質(zhì)(Z)的消耗速率加快，光下積累量減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)正義基因株系在過剩光能存在條件下的脫環(huán)氧化狀態(tài)降低。因此，轉(zhuǎn)正義基因株系依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散功能下降，PSⅡ的光抑制程度加重，對過剩光能的敏感性增加