玉米(zeamaysl.)nadph氧化酶基因克隆、表達(dá)特性及功能研究

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文玉米（Zea mays L.）NADPH氧化酶基因克隆、表達(dá)特性及功能研究姓名：林凡申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：蔣明義20081201博士學(xué)位論文：玉米( Z e am a y s L ．) N A D P H 氧化酶基因克隆、表達(dá)特性及功能研究物N A D P H 氧化酶活性的調(diào)控。Z m r b o h D - f l 是Z m r b o h D 基因外顯子4 部分被剪切的產(chǎn)物．它缺失了保守的N

2、 A D P H 氧化酶跨膜區(qū)序列，定位于細(xì)胞質(zhì)中．這是首次發(fā)現(xiàn)非膜定位的植物R B O H 蛋白．有證據(jù)顯示在玉米葉片A B A 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中M A P K 的活化和H 2 0 2 產(chǎn)生之間存在交叉對(duì)話(huà)．在此基礎(chǔ)上，采用藥理學(xué)方法和熒光定量R T - P C R 技術(shù)研究了H 2 0 2 、M A P K 和N A D P H 氧化酶基因( Z m r b o h ) 的轉(zhuǎn)錄在A(yíng) B A 信號(hào)途徑之間的關(guān)系。A B A 處理后，玉米

3、葉片中Z m r b o h A - D 基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比，出現(xiàn)雙階段快速、瞬時(shí)的上調(diào)。H 2 0 2 清除劑( D M T U 和C A T ) 或M A P K K 抑制劑( P D 9 8 0 5 9 和U 0 1 2 6 ) 的預(yù)處理能有效抑制A B A 誘導(dǎo)的Z m r b o h 基因階段I I 的轉(zhuǎn)錄，而不影響階段I 的變化．此外，H 2 0 2 ( 1 0 m M ) 處理也能誘導(dǎo)Z m r b o h 基因的表

4、達(dá)，且受M A P K K 抑制劑預(yù)處理的抑制．這些結(jié)果提示，A B A 能誘導(dǎo)Z m r b o h 基因的轉(zhuǎn)錄，該基因轉(zhuǎn)錄和H 2 0 2 、M A P K 之間存在交叉談話(huà)機(jī)制；一個(gè)與Z m r b o h 基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的正放大環(huán)路存在于A(yíng) B A 途徑中．玉米是世界上最重要的禾谷類(lèi)作物之一，也是植物研究的一種模式生物．但目前玉米的遺傳轉(zhuǎn)化仍然十分困難，沒(méi)有一套完整的被廣泛使用的轉(zhuǎn)化體系．本研究以8種玉米基因型為材料，對(duì)基因型、幼

5、胚大小、培養(yǎng)基激素組成等影響因素進(jìn)行對(duì)比，建立玉米登海1 l 號(hào)( D H l l ) 受體系統(tǒng)。而后以D H l l 的胚性愈傷組織為受體，研究了農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、篩選方式等因素對(duì)玉米轉(zhuǎn)化的影響．研究表明，菌液濃度和侵染時(shí)間相互作用是影響轉(zhuǎn)化效果的重要因素。在本研究條件下，菌液濃度O D 6 0 0= 0 ．6 ，侵染時(shí)間1 0 m i n 可以獲得較理想的轉(zhuǎn)化效率．作為一種商業(yè)化品種D H l l ，這一遺傳體系無(wú)需花費(fèi)大量

6、的精力進(jìn)行繁種，給研究者帶來(lái)了方便。在前期研究的基礎(chǔ)上，選取Z m r b o h B 基因?yàn)檠芯繉?duì)象，根據(jù)R N A 干涉原理構(gòu)建了其反向重復(fù)序列表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入D H l l 胚性愈傷組織．經(jīng)P C R 和熒光定量R T - P C R 檢測(cè)，初步證明Z m r b o h B 基因反向重復(fù)片段整合到玉米基因組中，并抑制了Z m r b o h B 基因的表達(dá)，獲得了該基因表達(dá)受抑制的變異體．分析它們對(duì)外源A B A