棉花多胺氧化酶GhPAOs基因的克隆及初步功能分析.pdf

1、目的：棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其中陸地棉產(chǎn)量占全世界棉花總產(chǎn)量的90％左右。我國(guó)是世界上最大的棉花消費(fèi)國(guó)，并且新疆是我國(guó)的植棉大省，2014年新疆種植面積和產(chǎn)量占到全國(guó)的46.3%和59.7%。眾所周知，低溫、鹽漬化、干旱等非生物脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，新疆棉花種植表現(xiàn)尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)多胺與抗逆也有密切的關(guān)系，多胺氧化酶（PAO）作為多胺氧化降解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,氧化多胺產(chǎn)生H2O2，H2O2與植物的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，尤其與非生

2、物脅迫有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)陸地棉PAO基因進(jìn)行克隆和功能分析，為研究多胺參與抗逆研究提供重要理論依據(jù)，也為利用基因工程手段進(jìn)行棉花遺傳改良提供參考。
　　方法：（1）利用同源序列法，結(jié)合雷蒙德氏棉基因組信息，以陸地棉cDNA為模版，克隆獲得GhPAO1/2/3基因。（2）利用qRT-PCR技術(shù)分析棉花不同組織和不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性。（3）利用Gateway技術(shù)構(gòu)建PGWB17-GhPAO1/2/3過(guò)表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化擬南

3、芥和棉花。（4）通過(guò)HPLC方法測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)PGWB17-GhPAO1擬南芥中多胺含量的變化。（5）通過(guò)DAB顯色試劑盒和H2O2測(cè)試試劑盒測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)PGWB17-GhPAO1擬南芥中H2O2含量的變化。
　　結(jié)果與結(jié)論：1.以擬南芥AtPAO1、AtPAO2和AtPAO5的cDNA序列為探針，在雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastn比對(duì)獲得同源PAO基因，設(shè)計(jì)特異性引物并利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得3個(gè)陸地棉PAO基因，命名為Gh

4、PAO1、GhPAO2和GhPAO3。對(duì)GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3的cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該基因cDNA全長(zhǎng)分別為1751 bp、2237 bp和1736 bp，開放閱讀框分別為1483 bp、1473 bp和1530 bp，分別編碼493、490和506個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白大小分別為55.3709KD、54.405 kD和56.88 kD，等電點(diǎn)都為5.31、5.69和5.77，編碼蛋白均為親水性蛋白。聚類分

5、析將其分為三類，棉花GhPAO1基因與可可樹TcPAO1、葡萄VvPAO1和擬南芥AtPAO1聚為一類；棉花GhPAO2基因與可可樹TcPAO2、葡萄VvPAO2、擬南芥AtPAO2、AtPAO3、煙草NtPAO2以及蘋果MdPAO2等聚為一類，棉花GhPAO3與可可樹TcPAO5、葡萄VvPAO5、擬南芥AtPAO5聚為一類。通過(guò)Real-time PCR對(duì)GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因在不同組織和多種非生物脅迫處理的表

6、達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)情況不同，GhPAO1基因在棉花莖中表達(dá)最高， GhPAO2基因主要在棉花花瓣和葉中表達(dá)，GhPAO3基因在棉花葉中的表達(dá)最高。不同脅迫處理?xiàng)l件下GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因表達(dá)量都發(fā)生顯著變化，其中GhPAO1基因在ABA處理和低溫處理后基因表達(dá)量迅速上升并在1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。GhPAO2基因在20%PEG處理和低溫處理后基因表達(dá)量迅速上升并在1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，

7、200 mmol?L-1NaCl和1mmol ABA處理則在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。GhPAO3在低溫處理和ABA處理后該基因在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，PEG處理后在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，NaCl則在處理后3 h時(shí)表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可能以不同的角色參與了棉花抗逆過(guò)程。
　　2.構(gòu)建超表達(dá)載體PGWB17-GhPAO1/2/3，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化模式植物

8、擬南芥，T1代進(jìn)行PCR驗(yàn)證抗性擬南芥，繼續(xù)篩選，GhPAO1獲得轉(zhuǎn)基因的純合體，并進(jìn)行qRT-PCR分析，選擇表達(dá)量高的陽(yáng)性株系進(jìn)行后續(xù)研究。（1）多胺含量測(cè)定表明，轉(zhuǎn)基因株系中多胺（PAs）總含量降低，Put的含量增加，Spd和Spm的含量降低。DAB顯色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因中H2O2含量增加。因此，我們推測(cè)GhPAO1基因在擬南芥中超表達(dá)后，可能參與了Spd和Spm的降解，產(chǎn)生更多的H2O2。（2）外源多胺和抑制劑處理擬南芥結(jié)果顯示，

9、外源多胺和PAO抑制劑（1,8-DO）能夠促進(jìn)擬南芥子葉變綠，而多胺抑制劑（D-Arg）抑制擬南芥子葉變綠。通過(guò)對(duì)不同處理下野生型和轉(zhuǎn)基因后代的H2O2含量分析表明，外源多胺處理時(shí)超表達(dá)GhPAO1基因可能通過(guò)氧化多胺造成H2O2含量增加，進(jìn)而對(duì)擬南芥綠色子葉產(chǎn)生影響。（3）NaCl及NaCl同時(shí)附加外源多胺處理下，GhPAO1轉(zhuǎn)基因擬南芥的綠色子葉率低于野生型，而轉(zhuǎn)基因擬南芥中H2O2含量高于野生型，推測(cè)H2O2的產(chǎn)生抑制了擬南芥的綠

10、色子葉。同時(shí)，用300 mmol NaCl處理野生型和GhPAO1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗，結(jié)果顯示，處理36 h后野生型擬南芥葉片出現(xiàn)卷曲和失水，甚至開始變黃，而轉(zhuǎn)基因株系葉片比較平展，失水較少。高效液相色譜分析300 mmol NaCl處理下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的PAs含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中多胺含量低于野生型。
　　3.將已構(gòu)建的植物表達(dá)載體PGWB17-GhPAO1/2/3通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染棉花YZ-1下胚軸，繼代獲得胚性愈傷，提取