棉花三個(gè)SAUR基因的克隆及其功能分析.pdf

1、棉花纖維是棉花胚珠表皮層發(fā)育成的單細(xì)胞毛狀體，其發(fā)育過(guò)程是由多種基因共同作用，受到轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、激素等不同水平、不同因子共同調(diào)控的復(fù)雜的生物過(guò)程。其中植物激素對(duì)纖維起始和伸長(zhǎng)起重要作用。生長(zhǎng)素主要通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)起促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)作用。棉花纖維發(fā)育伸長(zhǎng)期是影響棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵時(shí)期，鑒定和利用纖維伸長(zhǎng)相關(guān)的基因?qū)τ诮馕雒藁ɡw維發(fā)育的分子機(jī)理以及提高纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　李氏短絨棉突變體(Li

2、-1)是一個(gè)單基因顯性突變體，其棉絨不正常發(fā)育形成短絨。0-2 DPA(day post anthesis)的纖維起始和伸長(zhǎng)及纖維次生壁沉積均正常，但3 DPA的纖維開(kāi)始發(fā)生畸形，所以是研究纖維伸長(zhǎng)和次生壁合成的理想材料。本實(shí)驗(yàn)室前期用Microarray實(shí)驗(yàn)對(duì)Li-1及野生型近等基因系TM-1的0 DPA胚珠及3 DPA和6 DPA纖維基因表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素在棉花纖維伸長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，并鑒定出3個(gè)在Li-1纖維中下

3、調(diào)表達(dá)的SAUR(SmallAuxin Up-regulated RNAs)基因。它們分別與擬南芥AtSA UR68(或AtSAUR67)和兩個(gè)編碼SAUR類似蛋白基因(分別為AT1G75590和AT2G46690)相似度最高，故暫將這3個(gè)基因分別命名為GhSA UR68、GhSA UR-like1和GhSA UR-like2。本研究克隆了這3個(gè)基因，進(jìn)行時(shí)空表達(dá)特征分析和亞細(xì)胞定位分析。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化擬南芥和棉花，獲得GhS

4、A UR68基因和GhSA UR-like2基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代，初步分析了這3個(gè)基因的功能。研究結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)3個(gè)基因的Unigene(探針號(hào)GhiAffx.24789.1.S1_at、Ghi.5859.1.A1_s_at和Ghi.5444.1.S1_at)序列，克隆了基因的全長(zhǎng)cDNA。其中，GhSA_UR68的cDNA全長(zhǎng)為553bp，ORF全長(zhǎng)為444bp，編碼148個(gè)氨基酸，分子量為36.42 kDa

5、; GhSAUR-like1的cDNA全長(zhǎng)為638bp，ORF全長(zhǎng)為474bp，編碼158個(gè)氨基酸，分子量為39.34 kDa; GhSA UR-like2的cDNA全長(zhǎng)為747bp，ORF全長(zhǎng)為369bp，編碼123個(gè)氨基酸，分子量為29.95 kDa，均為小分子蛋白。
　　2、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)GhSAUR68、GhSAUR-like1和GhSAUR-like2進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，結(jié)果顯示3個(gè)基因在胚珠和纖維中表達(dá)量均

6、顯著高于根、莖、葉，且在TM-1中的表達(dá)量比在Li-1中高。在Li-1的6 DPA、10 DPA和20 DPA纖維中表達(dá)量明顯低于TM-1，說(shuō)明這3個(gè)棉花SAUR基因可能在纖維伸長(zhǎng)和次生壁加厚發(fā)育時(shí)期發(fā)揮作用。
　　3、用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為GhSAUR68定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核;GhSAUR-like1定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核;GhSAUR-like2定位在細(xì)胞核。3個(gè)基因均定位于細(xì)胞核，說(shuō)明這3個(gè)基因可處

7、于生長(zhǎng)素信號(hào)通路的下游，GhSAUR68和GhSAUR-like1還同時(shí)定位于細(xì)胞膜，說(shuō)明它們還可能作用于其他信號(hào)通路過(guò)程。
　　4、將3個(gè)棉花SAUR基因ORF全長(zhǎng)構(gòu)建到35S-pBI121表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌泡花法將它們導(dǎo)入擬南芥。GhSA UR68轉(zhuǎn)基因苗中有62.5％心葉不生長(zhǎng)或白化，植株表現(xiàn)正常的占37.5％，經(jīng)過(guò)卡那霉素(Kan+)抗性篩選及PCR檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)GhSAUR68基因擬南芥18株陽(yáng)性植株GUS染色結(jié)果顯示G

8、hSA UR68在根和老葉中特異表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)緩慢、生育期推遲及葉片有早衰現(xiàn)象，并且葉片表皮毛狀體凸起比野生型明顯。經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選及PCR檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)GhSA UR-like基因擬南芥5株陽(yáng)性植株。與野生型相比，GhSA UR-like2轉(zhuǎn)基因苗根長(zhǎng)變短、側(cè)根數(shù)目增加，也出現(xiàn)不長(zhǎng)心葉的現(xiàn)象，但葉片表皮毛狀體輕微減少。以上結(jié)果表明G hSA UR68在擬南芥中過(guò)表達(dá)影響擬南芥生育期及葉片正常生長(zhǎng)卻可能促進(jìn)毛狀體發(fā)育;GhSA

9、 UR-like過(guò)表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育作用不明顯，但可能不利于毛狀體生長(zhǎng)發(fā)育。
　　5、觀察GhSA UR68和GhSA UR-like2擬南芥同源基因AtSAUR68和AT2G46690的突變體表型及其對(duì)生長(zhǎng)素(IAA)和赤霉素(GA3)處理的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下這兩個(gè)突變體根長(zhǎng)均比野生型的短。5μMLAA處理?xiàng)l件下，兩種突變體和野生型的根及下胚軸發(fā)育均受到抑制。0.5μM GA3處理對(duì)兩種突變體和野生型生長(zhǎng)的影響均不明顯