棉花GhTED2基因的克隆和功能分析.pdf

1、細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種由細胞內基因控制的為維持內環(huán)境穩(wěn)定的自主衰亡過程。植物維管系統(tǒng)在植物組織各部分的聯結方面起著重要的作用，它是由機械組織、輸導組織、分生組織和薄壁組織四部分組成的，具有貯存和運輸物質、機械支持、傳遞信息、阻止真菌和其它寄生物入侵等功能。在高等植物中，輸導組織的主要代表是韌皮部和木質部。木質部是由木薄壁細胞、木纖維和管狀分子(tracheary element，TE)

2、組成的，管狀分子TE是一種高度特化的細胞。從PCD被引進植物生物學以來，許多研究都已經證明TE的分化是一種典型的PCD過程，但它含有一般細胞PCD所沒有的次生壁構建過程，因而不屬于常規(guī)意義上的PCD[1,2]。近些年來，維管組織分化的研究已經從細胞學水平進展到了分子水平。相關學者已從百日草(Zinnia elegans)葉肉細胞體外分化形成TE的過程中，克隆出了4個TE相關基因(TED1～4)[1,3]。其次，百日草葉肉細胞分化成木質部

3、管狀分子的實驗表明，TED2屬于編碼細胞NADPH氧化還原酶的一個基因，它的表達受到油菜素類固醇、Ca2/鈣調素等多種因子的正調控，其調控反應產生H2O2和O2，能夠誘發(fā)木質部管狀分子(tracheary element，TE)的PCD。
　　本研究內容主要涉及棉花GhTED2基因的克隆和構建該基因相應的表達載體，并進行煙草的轉化，得到該基因過量表達的轉基因植株進行功能鑒定。具體的研究方法是以已知的陸地棉cDNA文庫中的包含5'端

4、序列部分的TED2基因序列為基礎，利用3' RACE技術得到陸地棉TED2基因的3'端序列，首次從陸地棉中成功擴增出了全長為1371bp的陸地棉TED2cDNA全長序列，其中ORF為975bp，共編碼324個氨基酸（NCBI收錄號為FJ372981.1）。分別采用RT-PCR半定量法和Real-time PCR定量法對TED2基因在陸地棉根、莖、葉各組織中的表達量進行的分析，實驗結果表明該基因在陸地棉根、莖、葉各組織中均表達，其中在早期

5、發(fā)育的陸地棉根和葉中優(yōu)勢表達。利用植物表達載體pBI121作為骨架，將陸地棉TED2基因引入，構建成植物表達基因pBI121-TED2（簡寫為pBTED2），該基因由組成性表達啟動子CaMV35S驅動。通過農桿菌介導法轉化煙草，對轉基因不定芽進行選擇和根的再生，共獲得80個轉基因再生株。利用PCR初步篩查共獲得68株為轉基因PCR陽性株，進一步的分子檢測結果表明TED2基因已經成功的整合到轉基因煙草基因組中并在煙草中成功的進行了轉錄。同