棉花纖維發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子的表達分析和兩個基因的克隆與初步功能分析.pdf

1、棉花纖維是紡織工業(yè)的重要原料，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。纖維的發(fā)育從胚珠表皮細胞的分化和突起開始，并決定纖維的最終品質(zhì)和產(chǎn)量。因此從分子水平闡明棉纖維初始發(fā)育的機理以及影響纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的主要因素，具有重要的理論價值與現(xiàn)實意義。本研究選用3個無絨無絮突變體(XZ142 FLM、MD17、SL1-7-1)、2個無絨有絮突變體(N1N1、n2n2)和超短纖維突變體(Li1li1)進行棉花纖維初始發(fā)育和伸長發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子的表達分析，并和葉片

2、表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子進行比較，克隆1個負向調(diào)控的R3-MYB基因GhCPC和1個與細胞骨架相關的基因GhDIS2，初步闡述該基因的功能。
　　 1、棉花纖維和葉片轉(zhuǎn)錄因子的表達分析
　　 轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用并對轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結合蛋白。本研究對棉屬編碼GL1、GL2、GL3、WD40的轉(zhuǎn)錄因子進行表達分析。這些轉(zhuǎn)錄因子包括了編碼WD40的GhTTG1

3、、GhTTG2、GhTTG3、GhTTG4,編碼GL2的GhDEL61、GhDEL65，編碼GL3的GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3，編碼GL1的GhMYB2、GhMYB25、GhMYB109及其他MYB基因。
　　 掃描電鏡觀察突變體1 DPA胚珠表面，無絨無絮突變體表面光滑無突起細胞，2個無絨有絮突變體的纖維突起數(shù)量明顯少于野生型。從野生型和無絨無絮突變體的-3、0、1 DPA胚珠的差異表達分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG1、G

4、hTTG3、GhDEL61、 GhDEL65、GhMYB25等轉(zhuǎn)錄因子在不同時期的有纖維材料中優(yōu)勢表達。從野生型和無絨有絮突變體的1、3、5 DPA胚珠和纖維混合物的基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG3、GhTTG4、GhDEL61、GhMYB8等多個基因在無絨有絮突變體中低表達。
　　 超短纖維突變體(Li1li1)表現(xiàn)為纖維伸長停止，是研究纖維伸長發(fā)育早期的優(yōu)異種質(zhì)資源。從野生型和超短纖維突變體的差異表達分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG1

5、、GhDEL61、GhDEL65、GhMYB25、GhMYB38、G042C02A等轉(zhuǎn)錄因子在4 DPA野生纖維材料中優(yōu)勢表達。其中，G042C02A是本實驗室7235 cDNA文庫中一個克隆，是新的棉屬轉(zhuǎn)錄因子。
　　 掃描電鏡觀察陸地棉遺傳標準系TM-1和密生絨毛品系T586功能葉正面，T586葉正表面密布絨毛，而TM-1葉表面僅有球狀突起。選用這兩個材料分析轉(zhuǎn)錄因子在成熟葉片中的差異表達，GhMYB25、 GhDEL61在

6、T586中高表達。
　　 2、棉纖維發(fā)育負向調(diào)控因子GhCPC的克隆與鑒定
　　 MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一，有著廣泛的生理功能，幾乎參與植物發(fā)育和代謝的各個方面。在模式植物擬南芥(Arabidopsis)中，已克隆多個MYB轉(zhuǎn)錄因子，并鑒定其和表皮毛(Trichome)發(fā)育相關。CPC是表皮毛發(fā)育的負向調(diào)控因子，和bHLH競爭性結合，并抑制葉片表皮毛發(fā)育。
　　 本研究從TM-1開花當天胚

7、珠中克隆棉花CAPRICE(CPC)基因cDNA全長，包含240bp的ORF，編碼79個氨基酸，包含典型的R3-MYB基序?？寺hCPC在棉花突變體材料中的不同拷貝，分析了核苷酸和推導的氨基酸序列差異?；蚪M序列分析推測陸地棉的CPC基因可能來自G.herbaceum(A-genome)，基因組序列平均每73 bp一個SNP突變?；虮磉_分析發(fā)現(xiàn)，CPC基因在陸地棉TM-1不同時期的胚珠或纖維、根、葉中均有表達，表達最高值出現(xiàn)在3 D

8、PA的纖維，TM-1的莖不表達。分析該基因在不同突變體中的差異表達發(fā)現(xiàn)，0、1、3 DPA，TM-1中的表達量明顯低于無絨無絮和無絨有絮突變體的表達;TM-1葉片中的表達量明顯高于密生絨毛品系T586中的表達;在RIL純系中，有絨有絮純系的平均值顯著低于無絨有絮純系和無絨無絮純系。單標記分析，CPC基因和纖維表型性狀是相關的。
　　 TAIL-PCR克隆CPC基因的啟動子，陸地棉和G.herbaceum的CPC基因啟動子包含GA

9、RE-motif，而G.ramondii沒有。瞬時轉(zhuǎn)化上述兩種啟動子，證明其都有轉(zhuǎn)錄活性。CPC基因轉(zhuǎn)化離體培養(yǎng)的胚珠，顯著抑制纖維的生長，并受到GA3的影響。由此推測，CPC基因是棉花纖維發(fā)育的負向調(diào)控因子。
　　 3、棉花GhDIS2基因的克隆與初步功能分析
　　 轉(zhuǎn)錄因子隨核細胞骨架運輸?shù)秸{(diào)控位點，細胞骨架的形成和解聚影響轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。擬南芥DISTORTED2(DIS2)編碼ARP2/3復合體的ARPC2亞基。

10、dis2突變表現(xiàn)表皮層肌動蛋白成斑狀、微管在成簇的肌動蛋白附近異常聚集等。
　　 運用同源候選基因法從開花當天野生型胚珠中克隆棉花GhDIS2，該基因包括完整的975 bp的ORF，編碼324個氨基酸。表達分析發(fā)現(xiàn)，它在陸地棉TM-1不同來源的組織中均表達，于開花后12 d達到表達高峰，開花后18 d表達開始下降，根和莖的表達量較低。在四倍體棉花基因組中存在2個拷貝。轉(zhuǎn)化裂殖酵母，使該基因在真核細胞中表達，GhDIS2促使細胞擴