棉花GhMYBL基因克隆和初步表達(dá)分析.pdf

1、我國是重要的產(chǎn)棉大國和紡織品出口國，棉花在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位，提高棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)對我國民生意義重大，同時也是棉花育種的主要目標(biāo)。傳統(tǒng)育種方法難以達(dá)到產(chǎn)量和品質(zhì)的同步提高。利用基因工程方法可以打破物種間的遺傳障礙，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移，且后代易于穩(wěn)定，育種周期短，為進(jìn)一步改善棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了一條有效的途徑。利用基因工程改良棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，首先必須清楚棉花生殖發(fā)育過程的分子機(jī)制。因此，分離與棉花生殖發(fā)育相關(guān)基因

2、，分析基因功能和解析棉花生殖發(fā)育的分子機(jī)制對改良棉花產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及代謝調(diào)控等各個方面，研究工作表明，它們在植物的發(fā)育調(diào)控中起重要作用，因此研究轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育調(diào)控領(lǐng)域的功能作用意義重大(Martin C．，1996)。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，功能也最多樣化。目前棉花中關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究大多集中在棉纖維這一領(lǐng)域，在其它方面的研究，尤其在

3、與棉花生殖發(fā)育密切相關(guān)的花藥這一塊的研究，鮮見報(bào)道。因此，加快棉花花藥中MYB轉(zhuǎn)錄因子這一領(lǐng)域的研究有很現(xiàn)實(shí)的意義。 我們從棉花幼花cDNA文庫中分離克隆了30個轉(zhuǎn)錄因子的基因。通過生物信息學(xué)方法以及表達(dá)模式的分析，我們從中挑選了一個與MYB蛋白具有同源性、在花藥中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子作為我們進(jìn)一步研究的對象，并命名為GhMYBL。我們對該基因進(jìn)行了分子克隆和表達(dá)模式分析，并利用棉花的遺傳轉(zhuǎn)化分析該基因功能，以此深化對棉花MYB基

4、因的結(jié)構(gòu)、保守性、相關(guān)功能以及表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識。主要結(jié)果如下： 1．棉花GhMTBL的分離鑒定通過生物信息學(xué)方法，我們將在棉花幼花cDNA文庫中分離得到的30個轉(zhuǎn)錄因子基因與基因庫中的其它基因進(jìn)行比較和同源性分析；同時，利用實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)方法進(jìn)行表達(dá)模式分析。結(jié)合這兩個方面的數(shù)據(jù)，我們從中挑選出一個在棉花花藥中特異表達(dá)的MYB基因，并命名為GhMYBL。序列分析表明，GhMYBL編碼一個含有210個氨基酸的蛋白

5、質(zhì)，包含有兩個MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB亞類。RT-PCR結(jié)果顯示GhMYBL在花藥組織中特異表達(dá)，因而推測GhMYBL與花藥的發(fā)育相關(guān)。 2．棉花GhMYBL在花藥中特異表達(dá)用改良的熱酚法提取棉花發(fā)育早期各組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-PCR的方法對30個棉花轉(zhuǎn)錄因子基因的進(jìn)行表達(dá)模式分析，從中篩選出在棉花花藥中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因GhMYBL。然后，提取棉花不同組織不同時期的RNA，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后，做Nort

6、hern雜交分析。Northern雜交結(jié)果顯示GhMYBL在棉花花藥中表達(dá)量最高，在花瓣中微量表達(dá)，而在其它組織中沒有檢測到此基因的表達(dá)，其結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明GhMYBL基因是組織特異性表達(dá)，與花藥組織的發(fā)育相關(guān)。 3．載體的構(gòu)建和棉花轉(zhuǎn)化利用DNA重組技術(shù)，將GhMYBL基因克隆到pBI121質(zhì)粒中，分別構(gòu)建了過量表達(dá)載體(overexpression vector)和RNAi(supression ve