棉花和番茄P-ATPases基因的克隆及功能的初步分析.pdf

1、P-type ATPases是真核生物和很多原核生物中具有重要作用的酶，與植物生長發(fā)育以及植物逆境抗性等有密切關系。目前，還未見到關于研究棉花和番茄P-typeATPases的報道。
　　 本研究克隆了棉花和番茄的P-type ATPases基因，分析該基因在植物不同器官組織和多種逆境條件下的表達情況，并分別轉化煙草或番茄，初步闡明其在植物生長發(fā)育和逆境抗性中的作用，為這兩種作物的遺傳改良奠定基礎。主要研究結果如下：
　　

2、 1.利用棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列，在GeneBank中搜索棉花EST序列，得到棉花兩個同源的EST片段，結合RACE和Genomewalking獲得了這個基因的完整讀碼框序列，其開放閱讀框長為3570bp，編碼1190個氨基酸，與毛果楊、蓖麻的氨基酸同源相似性達90％左右，命名為Gbpatp。
　　 亞細胞定位結果顯示Gbpatp編碼的蛋白分布

3、在細胞膜上。RT-PCR檢測組織表達特異性分析表明，棉花P-type ATPases在莖和棉鈴中的表達量較高，在種子中有低水平表達，而在葉子和花蕾中表達量極低，說明Gbpatp可能與棉花莖、棉鈴和種子的生長發(fā)育密切相關。棉花幼苗在干旱處理后，Gbpatp的表達量大幅提高，并且隨處理時間延長表達量逐漸增加；重金屬Cu2+處理后Gbpatp的表達量升高，但48h比24h的表達量顯著下降；低溫處理24h Gbpatp的表達量略有升高。外源激素

4、誘導后發(fā)現(xiàn)，Gbpatp對外源GA和ABA均有響應，隨誘導時間延長Gbpatp在24h和48h的表達量維持在一定水平。據此推測Gbpatp基因與植物逆境抗性有密切關系。
　　 為研究棉花Gbpatp基因的功能，構建過量表達載體PCXSN-Gbpatp，轉化煙草，獲得12株轉基因植株。
　　 2.在GeneBank中搜索到番茄的兩個EST序列與黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type

5、ATPases蛋白序列同源，分別為TC192175和 BP896315。將檢索到的EST序列對照BAC文庫進行比對和拼接，根據生物學軟件預測開放閱讀框，并設計引物擴增番茄cDNA序列，得到一完整序列，命名為Lepatp。
　　 根據 Lepatp基因序列構建RNA干擾載體2301-P1-P2，農桿菌介導法轉化番茄，再生植株經PCR檢測，獲得11株轉基因植株。轉基因植株RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)5株植株沒有檢測到Lepatp基因，說明L

6、epatp基因的表達已成功被抑制。與非轉基因對照相比，Lepatp基因的表達沉默抑制了根系的發(fā)育，說明Lepatp基因與植物根系的生長發(fā)育相關，可能影響植物的營養(yǎng)吸收、生長和抗逆性等。
　　 3.根據已克隆的番茄Lepatp基因序列，電子克隆該基因的啟動子序列，并構建植物表達載體轉化擬南芥。PCR檢測獲得4株轉基因植株。為了觀察番茄P-type ATPases基因啟動子在擬南芥中的表達特征，取轉基因擬南芥的各個器官進行GUS組織