番茄SlASA1基因的克隆及功能分析.pdf

1、生長素是植物生長激素中最為重要的一種激素,它通過調(diào)節(jié)早期生長素響應(yīng)基因的表達(dá),從而控制植物生長發(fā)育的多個階段,如:頂端優(yōu)勢、向性生長、側(cè)根的形成、微管的分化、胚胎發(fā)育等。番茄(Solanum lycopersicum)是研究果實(shí)發(fā)育與成熟調(diào)控的理想模式作物,具有基因組小、自花授粉易于純合、生長周期短(45-100天)、在溫室內(nèi)可周年生產(chǎn)、具有成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系等特點(diǎn)。由此本研究利用番茄作為材料來研究生長素基礎(chǔ)的生理生化機(jī)制,并進(jìn)一步探究

2、生長素對于果實(shí)發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)理。
　　ASA1基因編碼合成一種限速酶元件(Anthranilate synthase component I),可以促進(jìn)生長素前體鄰氨基苯甲酸的合成,同時在擬南芥中已被證實(shí),ASA1基因是生長素與乙烯互作的重要節(jié)點(diǎn),在植物生長發(fā)育過程中通過影響生長素的合成,發(fā)揮重要的作用。
　　本研究以番茄為研究材料,克隆了SlASA1基因,分析了它的特異性表達(dá)模式,以及對不同激素刺激,外界刺激的響應(yīng),通過

3、分離它的啟動子,構(gòu)建啟動子GUS表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化番茄進(jìn)一步確定它在番茄中的表達(dá)情況。同時,通過構(gòu)建超表達(dá)和干擾表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化番茄,得到轉(zhuǎn)基因植株觀察了在不同表達(dá)量情況下植株的生理和形態(tài)變化。從而初步明確了SlASA1介導(dǎo)的生長素含量變化對植物生長發(fā)育的影響。本研究主要取得以下研究成果:
　　1)參照擬南芥ASA1基因序列(NM_001203302.1),在番茄基因數(shù)據(jù)庫 SGN(http://solgenomics.net/)進(jìn)行比

4、對,得到番茄ASA1基因序列(SGN-U573188),序列全長1929bp,具有完整的開放閱讀框1347bp,編碼448個氨基酸。通過啟動子預(yù)測分析,分離出SlASA1基因上游2123 bp序列作為其啟動子,對啟動子功能元件分析發(fā)現(xiàn),啟動子中含有大量的乙烯和生長素響應(yīng)元件,負(fù)責(zé)種子發(fā)育和蛋白儲存的調(diào)控基因結(jié)合域,以及部分的赤霉素和脫落酸響應(yīng)元件。
　　2)組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),SlASA1基因在花蕾和果實(shí)中的表達(dá)量最高,在花中的

5、表達(dá)其次,在根莖葉中的表達(dá)相對較低。進(jìn)一步的對其花特異性表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其在雌蕊中表達(dá)量最高,在雄蕊,花瓣及萼片中的表達(dá)較低。揭示了SlASA1基因可能在花果及種子形成過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　3)將克隆的SlASA1基因,構(gòu)建到以CaMV35S為啟動子的表達(dá)載體pLP100上,成功得到pLP100-35s-ASA1超表達(dá)載體。選取基因中間約400bp大小的片段,采取干擾載體構(gòu)建方法,將其正反雙向構(gòu)建到pCambia-HP1

6、干擾載體上,成功得到pCambia-HP1-ASAi干擾載體。將擴(kuò)增得到的ASA1啟動子序列,構(gòu)建到pLP100表達(dá)載體上,成功得到pLP100-ProASA1-GUS載體。
　　4)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法,將pLP100-35s-ASA1、pCambia-HP1-ASAi、pLP100-ProASA1-GUS成功轉(zhuǎn)化至番茄,獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株,并進(jìn)行了鑒定。通過定量PCR的方法鑒定ASA1基因在對應(yīng)植株的表達(dá)情況。<

7、br>　　5)通過石蠟切片,掃描電鏡,鑒定了SlASA1基因?qū)χ参镂⒐芊只?表皮毛形成的影響,發(fā)現(xiàn)SlASA1基因的過量表達(dá)促進(jìn)植株木質(zhì)部細(xì)胞的分裂,同時通過促進(jìn)表皮細(xì)胞的分裂提高了植株表皮毛的數(shù)量,并且該基因的過量表達(dá)會降低葉片表面氣孔的數(shù)量,這對于提高植株的逆境抗性有著積極的作用。通過植株形態(tài)學(xué)表型的鑒定發(fā)現(xiàn),SlASA1基因的過量表達(dá)會使種子的干重降低,飽滿度差,而抑制表達(dá)則會形成無籽果實(shí),說明它在種子形成過程中發(fā)揮重要作用。

8、r>　　6)在SlASA1超表達(dá)株系中,通過對相關(guān)乙烯、生長素通路相關(guān)基因的檢測,對比野生型植株相應(yīng)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SlASA1基因的過量表達(dá)可以明顯抑制乙烯信號通路正向調(diào)控因子的表達(dá),同時可以提高生長素通路正向調(diào)控因子的表達(dá),從而說明了該基因在乙烯、生長素通路中的重要作用。
　　結(jié)果表明:SlASA1基因是一個重要的生長素合成功能基因,通過響應(yīng)乙烯信號介導(dǎo)調(diào)控生長素信號通路,正向地調(diào)控了植株生長素的合成、微管的形成、抗逆性和種子