番茄SlGRAS1基因的克隆及功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TFs）通常也也稱為反式作用因子，能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。
　　GRAS蛋白家族作為高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道在赤霉素信號(hào)通路、分生組織的維持和光敏色素信號(hào)通路等重要的生理過程以及植物抗逆過程中發(fā)揮重要的生理功能。該蛋白家族通常由400-770個(gè)氨基酸組成，羧基端高度保守，氨基端在序列長(zhǎng)度和種類上

2、復(fù)雜多變，同時(shí)決定著蛋白獨(dú)有的功能。迄今為止，大部分GRAS蛋白家族成員的功能尚未報(bào)道。
　　本研究以番茄（Solanum lycopersicum）為材料，對(duì)GRAS家族成員SlGRAS1進(jìn)行研究。首先從番茄基因組中克隆了SlGRAS1基因，分析了基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)域以及蛋白物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了GRAS蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)生樹；采用Real-time PCR方法研究了番茄SlGRAS1基因的時(shí)空表達(dá)模式以及非生物脅迫、外源激素

3、的響應(yīng)情況；構(gòu)建了超表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析以及與成熟相關(guān)基因的表達(dá)量檢測(cè)。初步分析了番茄SlGRAS1基因在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生物學(xué)功能。本研究得到的主要結(jié)果如下：
　　一、運(yùn)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlGRAS1基因全長(zhǎng)1629bp，編碼542個(gè)氨基酸，具有典型的GRAS家族特征；啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域具有許多功能元件，如光應(yīng)答元件、逆境應(yīng)答元件

4、和激素應(yīng)答元件。
　　二、蛋白預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)SlGRAS1蛋白的分子量和等電點(diǎn)分別為60.5KDa和5.52，預(yù)測(cè)可能為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白，無信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，因此不是分泌蛋白和膜蛋白。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹分析，SlGRAS1屬于PAT1亞家族，與AtSCL13具有83％的氨基酸序列相似性。
　　三、該基因的組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlGRAS1基因在花和莖中表達(dá)量較高，在果實(shí)坐果到成熟過程中，SlGRAS1基因在坐果和破色

5、期表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期。逆境脅迫響應(yīng)中，低溫和高溫處理對(duì)SlGRAS1基因的表達(dá)影響較大，氧脅迫、滲透壓脅迫和鹽脅迫對(duì)基因表達(dá)影響相對(duì)較小。外源激素響應(yīng)分析顯示，SlGRAS1基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到這些激素的調(diào)控，其中外源施加生長(zhǎng)素（Indole-3-acetic acid，IAA）和乙烯使得SlGRAS1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　四、構(gòu)建超表達(dá)載體K303-35S-SlGRAS1-GFP和干擾抑制載體pCambia13

6、01-AsSlGRAS1，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入番茄中獲得了超表達(dá)陽性植株，以野生型為對(duì)照，我們通過對(duì)T1代和T2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)SlGRAS1超表達(dá)植株具有株高變高，節(jié)間距伸長(zhǎng)以及果實(shí)成熟推遲的表型。
　　五、對(duì)果實(shí)成熟周期延長(zhǎng)的現(xiàn)象研究中，我們選取了超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期MG，Br，Br+4，Br+7的果實(shí)，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)篩選了與成熟相關(guān)的重要的基因，通過Real-time PC