番茄E3泛素連接酶SLBAH1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境中，面臨著各種微生物的挑戰(zhàn)。在這種長(zhǎng)期相互作用、相互影響的共進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸獲得了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來(lái)保護(hù)自己。這種先天免疫也是植物、昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物共有的防御病原菌感染的機(jī)制。植物能通過(guò)特異識(shí)別病原菌的細(xì)胞壁、代謝物等成分，直接或間接識(shí)別相應(yīng)的病原物，激活防御反應(yīng)信號(hào)、產(chǎn)生超敏反應(yīng)和一系列防御反應(yīng)物質(zhì)，最終產(chǎn)生抗病性。在植物的防御應(yīng)答過(guò)程中，植物體自身會(huì)發(fā)生重要的代謝改變，以維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理過(guò)程。其中，泛

2、素介導(dǎo)的蛋白調(diào)控是一種廣泛存在的調(diào)控機(jī)制，對(duì)調(diào)控正常的細(xì)胞功能和植物對(duì)環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)起著重要作用。本研究從番茄中克隆一個(gè)泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)基因，并對(duì)基因的功能進(jìn)行了研究。具體研究結(jié)果如下：
　?、鸥鶕?jù)BAH1基因序列，搜索番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得一個(gè)EST。根據(jù)EST，設(shè)計(jì)引物，采用3'-RACE方法擴(kuò)增獲得了全長(zhǎng)的SLBAH1基因的cDNA序列。序列分析顯示，SLBAH1基因全長(zhǎng)1002核苷酸，編

3、碼333氨基酸。功能預(yù)測(cè)顯示，編碼蛋白含有1個(gè)SPX結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING(really interesting new gene，RING)結(jié)構(gòu)域。
　　⑵根據(jù)SLBAH1基因全序列，設(shè)計(jì)引物，分別構(gòu)建了包含全基因序列、缺少RING結(jié)構(gòu)域基因序列和RING結(jié)構(gòu)基因序列的原核表達(dá)載體，表達(dá)了融合蛋白SLBAH1、SLBAH1dR和SLBAH1R。E3連接酶活性檢測(cè)顯示，SLBAH1和SLBAH1R具有體外泛素連接酶活性，而SLBAH

4、1dR無(wú)E3酶活性。
　　⑶構(gòu)建了35S-SlBAH1∷GFP融合蛋白，通過(guò)打基因槍的方法把質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入已在MS0中鋪好洋蔥表皮，利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，SLBAH1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　?、壤肦T-PCR方法對(duì)番茄中SLBAH1基因的器官特異性和對(duì)生物和非生物脅迫的表達(dá)特性進(jìn)行了研究分析。結(jié)果顯示，SLBAH1在根中的表達(dá)量高于葉和莖;并受灰霉病菌的誘導(dǎo)調(diào)控，在病原體感染的早期階段被激活，

5、之后表達(dá)量降低;防衛(wèi)信號(hào)分子ABA、SA和MeJA也能不同程度的誘導(dǎo)著SLBAH1基因的表達(dá)量。上述結(jié)果表明了，SLBAH1基因可能在自身防御病害方面發(fā)揮著作用。
　　⑸對(duì)番茄幼苗的離體葉片進(jìn)行灰霉菌離體接種當(dāng)經(jīng)PDS沉默的植株出現(xiàn)葉片退綠時(shí)，提取經(jīng)pTRV SlBAH1處理的番茄幼苗葉片的總RNA，用Real Time PCR方法檢測(cè)SlBAH1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，SlBAH1基因的表達(dá)量下調(diào)了30％～70％。生物形態(tài)觀察