TRIM22的E3泛素連接酶活性及其所介導(dǎo)生物學(xué)意義的研究.pdf

1、三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(tripartite motif,TRIM)屬于含有RING(really interestingnew gene)結(jié)構(gòu)域的RBCC蛋白家族的一大類分子,目前發(fā)現(xiàn)TRIM家族有近70個(gè)成員,含有相似的RBCC結(jié)構(gòu)序列,包括一個(gè)RING區(qū)、一個(gè)或兩個(gè)B-box區(qū)和一個(gè)卷曲螺旋區(qū)(coiled-coil)。C末端的結(jié)構(gòu)域則高度可變。研究顯示,TRIM蛋白家族成員參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程,如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、抗病毒、癌變和

2、凋亡等等。RING結(jié)構(gòu)域也是一大類RING E3泛素連接酶所共有的特征性結(jié)構(gòu)域。TRIM家族成員也具有特征性的RING結(jié)構(gòu)域,因而有理由認(rèn)為TRIM家族成員可能同樣具有E3泛素連接酶活性。迄今為止報(bào)道具有E3泛素連接酶活性的TRIM家族成員有:TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM25和TRIM37等。如TRIM25通過對(duì)模式識(shí)別受體RIG-Ⅰ的特異性降解作用,影響RIG-Ⅰ對(duì)RNA病毒的識(shí)別和下游信號(hào)通路的活化,從而影響機(jī)

3、體的抗病毒固有免疫應(yīng)答。TRIM21通過對(duì)IRF-8的泛素化降解作用,調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌,從而影響機(jī)體免疫應(yīng)答。TRIM家族成員參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程,可能通過其泛素連接酶活性發(fā)揮效應(yīng),值得重視研究。
　　 本研究中TRIM22(Tripartite motif-containing 22)為TRIM家族的成員之一,又稱為50kDa的刺激反式作用因子(stimulated trans-acting

4、 factor of 50 kDa,Staf50)。TRIM22是干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一,同時(shí)TRIM22也是p53的靶基因之一,然而TRIM22的具體功能還不是很清楚。已有研究證明TRIM22具有抗細(xì)胞增殖、抗病毒的能力,可能是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。目前還未見其具有泛素連接酶活性的報(bào)道,其生物學(xué)功能與泛素連接酶活性的關(guān)系也是未知的,因而本研究主旨是通過體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRIM22的E3泛素連接酶活性并探索其泛素連接酶活性所介導(dǎo)的生物學(xué)意

5、義。
　　 第一部分 TRIM22的E3泛素連接酶活性判斷一個(gè)蛋白為E3泛素連接酶,若此時(shí)對(duì)其靶蛋白還未知,為了證實(shí)其泛素連接酶活性可以首先證實(shí)其具有將自身進(jìn)行泛素化的能力,即自身泛素化,這也是幾乎所有E3泛素連接酶所共同具有的特點(diǎn),因而我們?cè)诒静糠盅芯苛薚RIM22的自身泛素化能力。采用RT-PCR的方法擴(kuò)增全長(zhǎng)TRIM22開放閱讀框架(ORF),將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)。為了進(jìn)行體外泛素連

6、接酶活性檢測(cè),我們構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的重組真核TRIM22表達(dá)載體pEBG/TRIM22,在真核細(xì)胞COS7表達(dá)GST-TRIM22,用GST樹脂凝膠純化TRIM22,體外泛素化反應(yīng)直接在結(jié)合GST-TRIM22的的凝膠上進(jìn)行。兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液具有所有種類的E1泛素活化酶和多種E2泛素結(jié)合酶,加入TRIM22和Ub進(jìn)行反應(yīng)后,用抗Ub抗體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大分子量的拖帶,表明TRIM22被加上多聚泛素鏈,進(jìn)一步我們選擇一個(gè)E2混合物(Ubc

7、H2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)進(jìn)行體外泛素化反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22也被泛素化,這些結(jié)果證明TRIM22是一個(gè)E3泛素連接酶,參與自身泛素化的過程。為確定TRIM22特異的E2,我們選擇分別用幾種具有代表性的E2(UbcH2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)進(jìn)行體外泛素化反應(yīng),發(fā)現(xiàn)UbcH5B是TRIM22進(jìn)行自身泛素化反應(yīng)所需要的E2。為在體內(nèi)驗(yàn)證TRIM22的泛素連接酶活性,我們

8、構(gòu)建了C端帶有myc表位的TRIM22重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA/TRIM22-myc,將其與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用抗c-myc抗體進(jìn)行免疫沉淀,用抗HA抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM22與HA—Ub共轉(zhuǎn)染組有明顯的大分子量拖帶,為典型的多聚泛素化反應(yīng)。同時(shí)我們觀察了蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)TRIM22泛素化反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)MG132能夠促進(jìn)帶有泛素鏈的TRIM22聚集而不能被蛋白酶體降解。為研究TRIM22泛素連接酶活性是否依賴

9、RING結(jié)構(gòu)域,我們分別將TRIM22的RING結(jié)構(gòu)域第15位關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變(C15A)和整個(gè)RING結(jié)構(gòu)域缺失(Del-R),體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其自身泛素化程度明顯下降或消失,表明TRIM22的泛素連接酶活性依賴于RING結(jié)構(gòu)域,是一個(gè)新的依賴RING結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶。
　　 第二部分 TRIM22的E3泛素連接酶活性介導(dǎo)的生物學(xué)意義第一部分證明了TRIM22具有體內(nèi)體外的E3泛素連接酶活性,然而TRIM22作用的蛋

10、白底物還不清楚,即其具有泛素連接酶活性的意義還未知并值得去探索。已有的研究結(jié)果顯示TRIM22具有抗細(xì)胞增殖、抗病毒和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能,然而沒有研究提示TRIM22的這些功能與泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)。
　　 有芯片研究結(jié)果報(bào)道,相比于正常個(gè)體,來源于自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人病情活動(dòng)期的CD4+T細(xì)胞表達(dá)高水平的TRIM22,提示TRIM22可能與自身免疫性疾病相關(guān)。已有研究認(rèn)為TRIM家族成員可能是潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,而

11、自身免疫性疾病常伴隨著關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的功能失調(diào)。綜合考慮相關(guān)研究背景,我們大膽猜想TRIM22、自身免疫性疾病和NF-κB信號(hào)通路這三者之間存在某種聯(lián)系,TRIM22通過影響NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,繼而與自身免疫性疾病的致病機(jī)制相關(guān)聯(lián)。NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)與泛素蛋白酶體系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,其活性受到多種E3泛素連接酶的調(diào)節(jié)。第一部分已經(jīng)證實(shí)TRIM22具有E3泛素連接酶活性,我們考慮TRIM22的泛素連接酶活性是否也參與

12、對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié),這也可為TRIM22泛素化作用的蛋白底物和介導(dǎo)的生物學(xué)意義找到線索。基于此我們嘗試探索TRIM22對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過螢光素酶報(bào)告基因的方法我們檢測(cè)了TRIM22對(duì)NF-κB、NF-AT和AP-1的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRIM22能夠促進(jìn)NF-κB啟動(dòng)子的活性,然而TRIM22對(duì)AP-1和NF-AT通路的影響不大。蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制NF-κB的活化,同樣發(fā)現(xiàn)TRIM22對(duì)NF-κB的活化

13、作用也被MG132抑制,提示TRIM22對(duì)NF-κB的活化作用是通過泛素蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)。TRIM22促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的作用也依賴于其與泛素連接酶活性密切相關(guān)的RING結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺失SPRY結(jié)構(gòu)域的TRIM22也喪失了促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的能力。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象,我們考慮是SPRY結(jié)構(gòu)域缺失使其蛋白定位發(fā)生改變所致。通過帶有C端Myc標(biāo)記的TRIM22的不同結(jié)構(gòu)域缺失和突變體,用間接免疫熒光方法觀察轉(zhuǎn)染這些異構(gòu)體后

14、其在COS7細(xì)胞內(nèi)的定位。發(fā)現(xiàn)TRIM22主要定位于胞核內(nèi),而RING結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涠ㄎ粵]有影響。缺失SPRY結(jié)構(gòu)域后TRIM22定位發(fā)生改變,不能進(jìn)入胞核。我們推測(cè)TRIM22促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性不僅與其泛素連接酶活性相關(guān),與其定位也相關(guān),TRIM22可能在細(xì)胞核內(nèi)參與對(duì)NF-κB信號(hào)通路某個(gè)抑制分子的泛素降解。
　　 綜上所述,本研究通過體內(nèi)體外泛素化檢測(cè)證實(shí)了TRIM22具有核泛素連接酶活性,而且其泛素連接酶活性依賴于其R