泛素連接酶(E3)gp78的RNA干擾對MHCC97-H細胞生物學行為及KAI1表達的影響.pdf

1、研究背景及目的
　　 肝癌是導致人類死亡率第二高的惡性腫瘤,尤其是其肝外轉移,更是臨床肝癌治療的難點。肝癌細胞通常早期經(jīng)過血道轉移至鄰近或遠處的組織器官,因此肝癌細胞具有很強的轉移侵襲能力,而這種轉移侵襲行為的發(fā)生機制則十分復雜。越來越多的研究認為,腫瘤細胞遷移和侵襲能力的增強,是腫瘤發(fā)生轉移的重要機制之一。先前在動物細胞株進行的研究已經(jīng)表明,gp78,作為一種與內質網(wǎng)相關性蛋白降解途徑(ERAD)相關的泛素連接酶(E3),其過

2、表達誘導了腫瘤細胞表型的變化,而這種變化卻增強了細胞的存活能力和增殖能力,細胞的侵襲潛力和活動能力也有所增強。最近有研究報道,腫瘤組織中gp78 mRNA水平表達較鄰近正常組織有顯著增高,并且有研究表明,腫瘤轉移抑制因子KAI1是gp78的特異性作用底物,gp78的E3酶活性可以通過對骨肉瘤細胞中腫瘤轉移抑制因子KAI1的降解來促進骨肉瘤的轉移。但是在肝細胞癌的轉移侵襲過程當中,gp78所發(fā)揮的作用現(xiàn)在還不太明了,尤其是在體外gp78對

3、肝癌細胞的生物學特性的影響仍不清楚。
　　 在本研究中,我們假設肝癌細胞中gp78表達減少可能導致KAI1表達水平的增高,從而使腫瘤細胞增殖、形成克隆以及遷移和侵襲能力的下降,進而推斷可能減弱肝癌的轉移能力。為了驗證這個假設,我們運用RNAi技術沉默肝癌細胞MHCC97-H中gp78的表達,檢測gp78沉默前后肝癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學活性的變化,同時也檢測了gp78沉默前后肝癌細胞中KAI1的表達。
　　 研究方

4、法
　　 1、根據(jù)gp78基因序列(GeneBank NM_001144,通過www.genscript.com網(wǎng)站在線siRNA設計工具,設計三對siRNA,定向插入到質粒pRNA-U6-1/Neo,抽提質粒并測序鑒定。構建好的三種gp78干擾載體分別命名為pRNAi-1,pRNAi-2與pRNAi-3。將細胞接種于6孔板,待細胞融合率達80％～90％時,用脂質體介導的基因轉染方法將構建好的gp78干擾載體與空載體轉入MHCC

5、97-H細胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉染的細胞系。
　　 2、采用不同的實驗技術檢測gp78 RNAi前后MHCC97-H細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力的變化。
　　 3、運用RT-PCR與Western Blot法檢測gp78 RNAi前后MHCC97-H細胞中gp78與KAI1的表達。
　　 結果
　　 1、構建的干擾重組載體經(jīng)測序比對,插入的寡核苷酸序列與設計的靶點序列完全吻合,說明干

6、擾重組載體構建成功,經(jīng)過G418篩選和克隆挑選,獲得穩(wěn)定轉染的細胞株,轉染細胞在激光共聚焦顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光。
　　 2、3種siRNA真核表達質粒有兩種可以有效抑制gp78的表達,其中以pRNAi-2作用效果最為明顯。
　　 3、MTT實驗表明干擾組細胞增殖能力明顯低于MHCC97-H組和空載體組細胞；平板克隆形成實驗表明干擾組單個細胞形成克隆的能力與MHCC97-H組和空載體組細胞相比顯著降低；細胞劃痕愈合實驗表

7、明干擾組細胞遷移能力明顯低于MHCC97-H組和空載體組細胞；Transwell侵襲小室實驗表明干擾組細胞侵襲能力與MHCC97-H組和空載體組細胞相比顯著降低；
　　 4、運用RT-PCR與Western Blot檢測,干擾組細胞的。KAI1表達高于MHCC97-H和空載體組細胞。
　　 結論
　　 gp78特異性RNA干擾能有效抑制MHCC97-H細胞中gp78的表達,并上調了KAI1基因的表達,從而間接降低